RNA-Seq技術(shù)，一直在進(jìn)步
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發(fā)布時(shí)間：2017-09-15
2009年，耶魯大學(xué)的科學(xué)家如此評價(jià)RNA測序：這些使用RNA-Seq的研究已改變了我們對真核轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜程度的看法。RNA-Seq能夠比其他方法更準(zhǔn)確地測量轉(zhuǎn)錄本及其他異構(gòu)體的水平。如今，分子生物學(xué)家已將RNA-Seq視為探索RNA的最靈敏方法。
在RNA-Seq出現(xiàn)之前，科學(xué)家往往采用芯片來分析轉(zhuǎn)錄本。“它存在背景和交叉雜交的問題，并且不能檢測重復(fù)序列的RNA轉(zhuǎn)錄本，”NEB的應(yīng)用科學(xué)家Daniela Munafo解釋說。此外，芯片只能測定已知的RNA轉(zhuǎn)錄本的相對豐度，無法檢測極微小的基因表達(dá)水平改變，而這對于了解生物反應(yīng)至關(guān)重要。
相比之下，RNA-Seq具有很多優(yōu)勢。它能以單堿基分辨率測定特定基因的表達(dá)水平，了解等位基因特異性表達(dá)、選擇性剪接、RNA編輯等等。RNA-Seq讀取轉(zhuǎn)錄組序列的能力也讓以前未研究過的新事件或新物種得以鑒定，而無需背景知識。
聚焦單個(gè)細(xì)胞
細(xì)胞分離技術(shù)的進(jìn)步讓RNA-Seq開始應(yīng)用在單個(gè)細(xì)胞上，而不再是一大塊樣本 。NEB的開發(fā)科學(xué)家Keerthana Krishnan認(rèn)為：“單細(xì)胞或細(xì)胞亞群的高分辨率測序可揭示樣本的復(fù)雜性。對疾病進(jìn)展的模型而言，這有助于確定突變來源的細(xì)胞?！?/span>
在被問及單細(xì)胞RNA-Seq的主要應(yīng)用時(shí)，Bio-Rad的高級產(chǎn)品經(jīng)理Dan Norton指出：“盡管它的應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛，但免疫學(xué)一直是一個(gè)巨大的推動力。這主要是因?yàn)椋鄬τ趯?shí)體組織的原代細(xì)胞而言，免疫細(xì)胞更容易獲得和分析。從自身免疫性疾病到免疫腫瘤學(xué)，研究人員正在研究免疫系統(tǒng)自身的疾病，以及如何利用免疫系統(tǒng)來對付其他疾病?！?/span>
發(fā)育生物學(xué)是另一個(gè)主要的應(yīng)用領(lǐng)域。Norton指出，它的應(yīng)用范圍包括利用干細(xì)胞來重現(xiàn)正常的身體過程、疾病狀態(tài)和器官，以及了解細(xì)胞分化的關(guān)鍵發(fā)育階段。
組織和腫瘤鑒定也一直受到關(guān)注?！巴ㄟ^研究樣本中的細(xì)胞分類，研究人員可以回答一些問題，比如哪些群體存在，它們?nèi)绾坞S著特定疾病而改變，以及如何鑒定一般的細(xì)胞群體，”Norton說?！敖M織鑒定是全方位的，從胰島到肝臟、心臟和腫瘤活檢?！?/span>
通過研究單細(xì)胞中的RNA，“你可以看到組織內(nèi)的某些細(xì)胞存在哪些轉(zhuǎn)錄本，有哪些不同的細(xì)胞類型，以及它們?nèi)绾坞S著時(shí)間或條件而變化，”Norton解釋道?！熬科浔举|(zhì)，單細(xì)胞測序提供了重要的分辨率?！?/span>
在某些情況下，比如癌癥，研究人員希望鑒定極其罕見的細(xì)胞群體，因?yàn)樗鼈冊诳寺⊙莼衅鹆酥匾淖饔茫_(dá)到這一檢測水平卻不一定實(shí)際。“為了檢測極其罕見的細(xì)胞群體，人們需要讓測序達(dá)到一定的深度，這不太經(jīng)濟(jì)，”Norton說。
當(dāng)然，獲取單細(xì)胞的方法也是一個(gè)絆腳石。Norton認(rèn)為，目前并沒有一個(gè)解離組織的標(biāo)準(zhǔn)方案，往往要犧牲細(xì)胞活力，或因細(xì)胞應(yīng)激而引起轉(zhuǎn)錄組的變化。因此，盡管單細(xì)胞RNA-Seq帶來巨大希望，但一些技術(shù)上的改進(jìn)有望使其更進(jìn)一步。
降低拼圖的難度
如今，科學(xué)家都想測序更長片段的DNA，以便更好地觀察完整的圖像。這就好像100塊的拼圖和1000塊的拼圖，難度根本就不是一個(gè)級別嘛。RNA-Seq也是如此。人們已經(jīng)開發(fā)出一些方法。
據(jù)Pacific Biosciences的農(nóng)業(yè)應(yīng)用總監(jiān)Emily Hatas介紹，PacBio已開發(fā)出全長轉(zhuǎn)錄本測序方法Iso-Seq，采用的是長讀長的單分子實(shí)時(shí)測序（SMRT）技術(shù)。短讀長的測序方法會打斷轉(zhuǎn)錄本，開展測序，然后利用生物信息學(xué)將數(shù)據(jù)拼在一起?！斑@個(gè)組裝的過程特別容易出錯(cuò)，特別是在確定轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)時(shí)，”Hatas說。
利用Iso-Seq方法，一個(gè)與PacBio合作的研究小組表明，雞的轉(zhuǎn)錄組在復(fù)雜性上與人類不相上下。在過去的嘗試中，研究人員表示很難從短讀長的RNA-Seq數(shù)據(jù)中鑒定轉(zhuǎn)錄本。有了長的序列，可變轉(zhuǎn)錄事件的相對比例說明了雞和人類轉(zhuǎn)錄組的相似之處，同時(shí)也解釋了之前觀察到的基因組差異。
近日，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的團(tuán)隊(duì)也利用這種方法來解析家兔的轉(zhuǎn)錄組。他們的分析證明了“通過PacBio測序得到的轉(zhuǎn)錄本，在10個(gè)MHC基因中重建高度同源序列的能力明顯高于來自短讀長組裝的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)”。而“短讀長通過de novo組裝，往往容易得到片段化或是混亂的轉(zhuǎn)錄本”。
深入挖掘數(shù)據(jù)
無論RNA-Seq本身有什么進(jìn)展，數(shù)據(jù)分析將仍是關(guān)鍵的一步。它涉及到聚類，從字面上講是將相似事物的數(shù)據(jù)分組，如轉(zhuǎn)錄本。舉個(gè)例子，人們可以將同一種癌癥的患者轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)分組。
一些科學(xué)家將RNA-Seq的樣本聚類應(yīng)用到癌癥數(shù)據(jù)上。“我們的評估考察了表達(dá)評估、非特異篩選后的基因數(shù)量和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換的策略，”他們總結(jié)道?！敖Y(jié)果表明，基于基因定量的癌癥樣本聚類應(yīng)優(yōu)先考慮?！?/span>
RNA-Seq的結(jié)果取決于樣本采集和制備，測序方法和平臺，以及分析數(shù)據(jù)的計(jì)算方法。各個(gè)方面的選擇都在不斷增加。分子生物學(xué)家深信利用RNA-Seq可以解決更多的難題，因?yàn)橐磺胁艅倓傞_始。
（本文轉(zhuǎn)載生物通）
