轉(zhuǎn)診：結(jié)核性腦膜炎 (TBM) 是最致命的結(jié)核病形式，約占所有肺外結(jié)核病例的 5所有活動性結(jié)核病例的 1? TBM 的患病率和患病率在 4 歲以下兒童和老年人中較高，尤其是重癥肺結(jié)核和免疫缺陷患者。最近的研究表明，病情惡化的TBM患者在診斷后約40～6個月內(nèi)死亡。腦部炎癥和腦損傷是TBM的主要特征。abbit 成立于 1923 年，作為 TBM 的實驗性人類疾病模型。第一個兔 TBM 模型包括蛛網(wǎng)膜下腔注射結(jié)核分枝桿菌（可能是 Mtb）、鳥分枝桿菌和牛分枝桿菌。用生理鹽水制備的接種物在注射后不會引起可見的反應(yīng)。然而，接種疫苗后 6 至 15 天，兔腦膜出現(xiàn)結(jié)節(jié)，出現(xiàn)麻痹等 TBM 癥狀，然后死亡。這項早期研究證明了人類和兔 TBM 模型在疾病進展和免疫病理學(xué)方面的相似性。重要的是，兔 TBM 模型的臨床和腦脊液 (CSF) 癥狀與人類疾病非常相似，其中淋巴細胞占主導(dǎo)地位，蛋白質(zhì)水平高，腦脊液變得粘稠。此外，基底膜和腦積水增厚是兔 TBM 模型和人類 TBM MRI 的常見異常。

　　為人類 TBM 建立兔子模型

　　我們的研究團隊首先使用高毒性 (HN878) 或高免疫原性 (CDC1551) 臨床 Mtb 分離株將兔子注射到大腦中。評估了 TBM 的嚴重程度。本研究使用 TBM 兔模型，該模型首先由 Dacey 和 Sande 發(fā)表。在這個模型中，第一天，兔子頭骨在麻醉下用四個 0.5 x 2 英寸鋁螺釘固定，并在細菌接種前肌肉注射氯胺酮（0.5 mL/kg）和甲苯噻嗪（3.5 mL/kg）。將這些螺釘放置在頭骨的額葉、頂葉和枕葉皮質(zhì)區(qū)域。它距顱骨頂部約 1 毫米，距矢狀縫約 2 毫米。使用 DuraBase Dental Acrylic 將半螺絲扣頭盔放在螺絲上。面罩允許新西蘭兔正確放置在立體定位框架中。在第 2 天，通過肌內(nèi)注射氯胺酮 (0.5 mL/kg) 和甲苯噻嗪 (3.5 mL/kg) 使動物鎮(zhèn)靜，并使用 0.25 x 4 英寸螺栓將動物的頭部牢固地放置在立體定位框架中。有助于穿透水箱進行細菌接種。將 3.5 x 25 G 脊髓針插入水箱，并注入 0.3 mL 的細菌接種液，其中含有大約 5 x 105 CFU。在感染后的指定時間點采集腦脊液和血液樣本用于下游分析。

　　以前的方法的基本限制是，將丙烯酸頭盔連接到頭骨所需的手術(shù)可能會引起二次感染。此外，在短時間內(nèi)（約3天）對動物進行多次鎮(zhèn)靜，戴上亞克力頭盔，接種細菌。金屬螺絲和亞克力頭盔的放置，以及各種鎮(zhèn)靜作用，都會給實驗動物帶來壓力。此外，該模型中使用的立體定向裝置沒有用于固定新西蘭兔頭部的適配器。新方法的一個重要變化是適配器的使用。非常適用于立體定向鏡架，可以牢牢固定新西蘭兔進行眼眶內(nèi)注射。這種方法還通過避免多次鎮(zhèn)靜程序來減輕對動物的壓力。這種方法側(cè)重于通過減輕疼痛和壓力來改善動物福利。所有動物操作，包括

　　Mtb 接種，都將在生物安全 3 級 (BSL-3) 設(shè)施中進行。以下所有步驟都必須在 II 類生物安全柜 (BSC-2) 中執(zhí)行。新西蘭兔被放置在另一個負壓籠中，籠子被放置在負壓室中。在進行動物感染實驗前，必須在門上懸掛生物安全警示牌，以警告其他人在實驗過程中不得進入。個人防護裝備：一次性特衛(wèi)強套裝、發(fā)帽、護目鏡、一次性靴子、雙層手套。電動空氣凈化器 (PAPR) 用于 (a) 受感染的動物、(b) 處理傳染性懸浮液和 (c) 尸體解剖。在剩下的過程中，您可以使用傳統(tǒng)的95 口罩。

　　動物感染準備：

　　1.在BSL2/BSL3動物設(shè)施中，體重2.4至2.6公斤的新西蘭白兔被單獨飼養(yǎng)和馴化約一周。

　　2.感染當天，新西蘭兔被轉(zhuǎn)移到BSL3設(shè)施，肌肉注射氯胺酮（35mg/kg）和甲苯噻嗪（5mg/kg）進行鎮(zhèn)靜。鎮(zhèn)靜后，通過隔離過濾箱將動物移至手術(shù)室。

　　3. 用電動剪刀刮掉新西蘭兔頭枕骨周圍的毛。

　　4. 將動物放置在不銹鋼桌子上的立體定向框架上，以方便顱內(nèi)穿刺。

　　細菌接種的準備：

　　5. 在 1xPBS 無菌鹽水中制備結(jié)核分枝桿菌懸浮液，濃度約為 5 × 106 cfu/mL。

　　6. 將菌懸液吸入安全柜中的 1cc 注射器中。使用特殊的安全裝置移除動物框架旁邊的針頭。

　　7. 取下 25G 脊椎針的中央導(dǎo)絲，拉回裝有接種物的 1cc 注射器的柱塞，在注射器尖端和接種物之間留下大約 0.2cc 的空氣屏障。小心地從 1cc 注射器中取出針頭并將其正確連接到 25g 脊椎針頭上，將保護套留在針頭上。將裝有脊髓針和細菌接種物的注射器放在有蓋的防漏轉(zhuǎn)移容器中，并將容器頂部放在浸泡在消毒劑中的紙巾上。密封容器，用 DeconPLus 擦拭布擦拭外部，并將其放置在立體定位框架旁邊。