目的： 構(gòu)建特異性抑制大鼠Raf-1基因的重組腺病毒載體,并將其體外轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞中進(jìn)行功能鑒定。

　　方法： 合成針對大鼠Raf-1的靶序列及陰性對照序列,經(jīng)退火形成的DNA雙鏈定向克隆到穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV中獲得pAdTrack-siRaf-1質(zhì)粒,PmeI線性化后在BJ5183細(xì)菌中與pAdEasy-1骨架質(zhì)粒進(jìn)行同源重組獲得pAd-siRaf-1質(zhì)粒,后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,包裝獲得pAd-siRaf-1腺病毒顆粒,繼而感染原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,通過Western blot方法檢測siRNA對Raf-1、NF-κB基因的抑制效率,液體閃爍計數(shù)儀測定3H-亮氨酸([3H]-leu)摻入率,用HJ2000圖像分析系統(tǒng)測定細(xì)胞表面積。

　　結(jié)果： 重組腺病毒載體經(jīng)酶切、鑒定正確,制備的病毒感染效率高,攜帶Raf-1的病毒顆粒能夠在蛋白水平有效抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞Raf-1的表達(dá)、細(xì)胞表面積及[3H]-leu的增加并下調(diào)Raf-1、NF-κB表達(dá)。

　　結(jié)論： 成功構(gòu)建了pAd-siRaf-1重組腺病毒載體,并在HEK293細(xì)胞中包裝成重組腺病毒,轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后能有效抑制Raf-1、NF-κB表達(dá),抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。