每一個(gè)做過分子克隆的人，都會(huì)經(jīng)歷過對(duì)條帶、對(duì)轉(zhuǎn)化子望眼欲穿的時(shí)刻，除了攢人品，每一步的細(xì)節(jié)也很重要。

一、PCR 引物設(shè)計(jì)

       通俗地說，很多人用了很多軟件設(shè)計(jì)來設(shè)計(jì)去，又是考慮發(fā)夾結(jié)構(gòu)，又是考慮二聚體，又是考慮 Tm 值，折騰來折騰去，但其實(shí)沒那么復(fù)雜。

       首先保證你要的基因是正確的，這個(gè)可以從 NCBI 中找到，大部分是沒問題的，然后再找到起始密碼子，從那開始大概上游取 20～27 bp，加上酶切位點(diǎn)，加上保護(hù)堿基（一般 3 個(gè)）就是上游引物，取后 20～27 bp 堿基，反向互補(bǔ)，加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基組成下游引物。這樣引物設(shè)計(jì)就完成了，可以放到軟件里看看 GC 含量，Tm 值，發(fā)夾結(jié)構(gòu)，二聚體等，適當(dāng)調(diào)整堿基個(gè)數(shù)和保護(hù)堿基的個(gè)數(shù)。需要額外注意的是移碼問題。

二、PCR 產(chǎn)物

       兩種方式：一種純化后直接酶切連接；一種連 T 載體再往下酶切連接。我個(gè)人強(qiáng)烈建議第二種，連 T 載體。

       PCR 產(chǎn)物直接酶切有兩個(gè)缺點(diǎn)：

       1. 由于兩頭把手太短，雖說有保護(hù)堿基，但我覺得還是不如從質(zhì)粒上往下切好切，而且容易切壞、切碎。

       2. 無法從電泳上看出來切沒切開，因?yàn)橐簿颓邢铝藥讉€(gè)或者十幾個(gè) bp，條帶沒啥變化。

       連 T 載體的優(yōu)點(diǎn)：

       1. 進(jìn)載體后，大提一次的質(zhì)?？鋸堻c(diǎn)說夠用一輩子的，再說 PCR 那東西還不太穩(wěn)定，一把多一把少的。

       2. 酶切會(huì)很清晰，切下來了就是有帶，沒切動(dòng)就是沒有，沒連上也能知道不是沒切開而是別的步驟有問題。

       連 T 載體也有些麻煩的地方，如需要的切點(diǎn)有時(shí)跟 T 載體上自帶的切點(diǎn)沖突，這就要小心鑒別。而且連 T 載體最好測(cè)序看一下 PCR 的產(chǎn)物對(duì)不對(duì)、切點(diǎn)對(duì)不對(duì)?？傮w來講連 T 載體是很有優(yōu)勢(shì)的。

三、提質(zhì)粒

       總體來說，提質(zhì)粒問題不大，都有試劑盒，按照步驟來，沒啥大問題。有時(shí)手工小提或粗提的質(zhì)粒酶切效果不好，這可能是提取的不夠純或者內(nèi)切酶品質(zhì)不好。所以若酶切效果不佳建議用柱子精提或大提。

四、酶切

       用于連接的酶切很關(guān)鍵。需注意如下幾點(diǎn)：

       1. 如果是雙酶切 A 和 B，預(yù)實(shí)驗(yàn)中必須做 A 和 B 各自的單酶切和 A+B 的雙酶切，務(wù)必確認(rèn)這幾種酶都好用，質(zhì)粒上的切點(diǎn)都好用。如果切不開就要考慮是不是酶的問題，buffer 的問題，質(zhì)粒上有沒有這些切點(diǎn)，序列是否甲基化等。盡量選實(shí)驗(yàn)室常用的內(nèi)切酶。

       2. 酶切盡量用大體系，如 50 uL、100 uL 等。大體系能稀釋內(nèi)切酶包裝中的甘油，對(duì)反應(yīng)有利。相反，連接盡量用小體系，以增加 DNA 末端的碰撞機(jī)會(huì)。

       3. 如果要回收、連接，酶切用的 DNA 量不用太大。大了會(huì)切碎，形成一些不規(guī)則的末端，不利于連接。

       4. 酶切后的電泳，即切膠的那次電泳中，如果切成的條帶很清晰，不拖泥帶水，沒有彌散，沒有拖尾，那做回收、連接效果最好。相反，若有彌散、拖尾、不清楚、一團(tuán)亮等情況就是切的不好，做后續(xù)實(shí)驗(yàn)成功率會(huì)降低。若真是效果很差建議改進(jìn)體系重新切。

五、回收

       回收可以用柱式試劑盒或手工法。

       柱式回收試劑盒：此類試劑盒適合各種長(zhǎng)度 DNA，對(duì)黏性末端基本沒有破壞，回收效率也不錯(cuò)。

       手工醇沉淀法：步驟如下，把切得的膠弄碎，用 Tris-HCl 浸泡一段時(shí)間，吸出所有的液體，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加鹽和醇醇沉，沉淀用 70% 乙醇漂洗，再用 Tris 溶解。這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是對(duì) DNA 和黏性末端的損傷最小，缺點(diǎn)是容易損失 DNA。若本來 DNA 數(shù)量就不多，用手工法很容易丟失殆盡。如果 DNA 量很大可以考慮使用。

       回收后要跑電泳，一來估算回收液濃度，二來看回收 DNA 的質(zhì)量。若條帶有彌散，即自目的條帶以下有拖痕，不是清晰利落的一條帶，則質(zhì)量不好。因?yàn)闂l帶拖痕表示它已碎裂成比它小的各種長(zhǎng)度的片段，而主帶雖然還在那個(gè)位置但也已遭到一定程度的破壞。質(zhì)量不好的回收產(chǎn)物做連接成功率會(huì)降低，假陽性克隆會(huì)增加。造成回收質(zhì)量差的原因可能是回收這步，也可能是酶切那步，如果酶切那步出現(xiàn)酶切中所描述的情況，就容易造成回收質(zhì)量不好。只有回收到清晰、利索的條帶，才不影響連接。

六、感受態(tài)

       做連接要求感受態(tài)的效率要高。感受態(tài)的感受效率一般剛制備完時(shí)是最高的，以后逐漸減弱，而且每次開－80℃ 冰箱，溫度微升對(duì)感受態(tài)效率都有一定影響，久而久之效率就不行了，這就要求大家取感受態(tài)時(shí)動(dòng)作迅速、最大程度減少感受態(tài)盒升溫。

       都知道感受態(tài)效率高好，但麻煩的是感受態(tài)效率的高低不好通過實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)，因?yàn)槿敉ㄟ^轉(zhuǎn)質(zhì)粒來檢測(cè)，只要是效率中等的感受態(tài)都能長(zhǎng)出很多克隆。所以如果你們的感受態(tài)已經(jīng)儲(chǔ)存了很長(zhǎng)時(shí)間或者連接長(zhǎng)的克隆連續(xù)幾把都太少就要重做感受態(tài)了。

       制備感受態(tài)不推薦新手直接去做，最好由經(jīng)驗(yàn)豐富者做或他帶你做。用新做的感受態(tài)轉(zhuǎn)質(zhì)粒，用同樣手法用量，你會(huì)發(fā)現(xiàn)比舊感受態(tài)明顯多長(zhǎng)很多克隆。此外可以考慮購(gòu)買感受態(tài)。

七、連接

       最后才輪到連接。連接的問題討論的是比較多的。如果前述若干步驟所得產(chǎn)物質(zhì)量好，連接不會(huì)很難。

       1.DNA 的量：DNA 總量有幾十 ng 就能連接成。當(dāng)然如果你的 DNA 質(zhì)量好 DNA 用量越大連接效率越高。就怕你為了追求 DNA 數(shù)量而降低了質(zhì)量，那可就得不償失了。

       2.vector 和 insert 的比例：如果 insert 不長(zhǎng)（2 kb 以下）、vector 是 insert 的幾倍長(zhǎng)，可以用 1：3～1：9。如果 insert 較長(zhǎng)（3～4 kb 以上）、vector 和 insert 長(zhǎng)度相似或 insert 比 vector 還長(zhǎng)，可以用 1：1～1：3。短片段的連接相對(duì)容易，做的好可以挑到好多正確的克隆。長(zhǎng)片段的連接效率較低，陽性克隆率小于等于 10% 是很正常的。我做過一個(gè)長(zhǎng)片斷的連接，6 k 的 vector、6 k 的 insert，比例用 1：1，挑了 20 個(gè)克隆有一個(gè)對(duì)。

       3. 體系體積：通常用 20 uL 都能連上，若連長(zhǎng)片段可以壓縮成 10 uL（前提是 DNA 數(shù)量不變）。我覺得體系不是很關(guān)鍵，有位很精通克隆的老師說他都用 50 uL 體系，照樣百發(fā)百中。而且如果你的 DNA 是用 EB（即 Tris）溶解的，體系中不加水也行。前述我自己連的長(zhǎng)片段也是用 20 uL 體系，vector 和 insert 各上 8 uL。

       4.T4 連接酶：酶這東西自然是越貴越好，一分錢一分貨，而且連接酶控制著整個(gè)分子克隆過程的瓶頸——連接，強(qiáng)烈建議買好的。如果連長(zhǎng)片段就加二倍的連接酶。

       5. 連接時(shí)間：過夜就應(yīng)該足夠了，但是你要是不急著轉(zhuǎn)化，放到 4 度放幾天也行，我個(gè)人認(rèn)為時(shí)間長(zhǎng)只好不壞。

       6. 連接溫度：最適是 16℃。有人用 PCR 儀造 16℃，也有人用水浴鍋。我用泡沫冰盒加涼水再添冰，用手感覺差不多十四五六度，然后蓋蓋過夜，基本上溫度不太變。你若感覺好不溫度，拿個(gè)溫度計(jì)測(cè)也行。有人用 4℃ 連接，也行，我有時(shí)先 16℃ 過夜，再放 4℃ 里幾天。

       7. 轉(zhuǎn)化：連接的轉(zhuǎn)化不能像轉(zhuǎn)質(zhì)粒那么隨便，要小心翼翼，盡量作到不放棄任何一個(gè)菌。一般所用的感受態(tài)體積最少是連接體系的 5 倍。長(zhǎng)片段的連接轉(zhuǎn)化時(shí)搖菌 2 小時(shí)。

       8. 對(duì)照：對(duì)照很關(guān)鍵，可以反應(yīng)出很多重要的信息，不要懶，你的連接若是問題不少，就要乖乖的做對(duì)照。一般有如下幾種對(duì)照方式：

       9. 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒對(duì)照。和連接產(chǎn)物同樣抗性、一起轉(zhuǎn)化、涂在同一個(gè)板上。這個(gè)對(duì)照目的是檢測(cè)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是否有效，即抗生素是否有效、板子是否有效、轉(zhuǎn)化的手法是否正確、以及感受態(tài)的效率如何（這需要你每次轉(zhuǎn)化質(zhì)粒都用相同的手法、用量，看長(zhǎng)的菌落數(shù)，若明顯太少就要懷疑感受態(tài)）。還有一個(gè)作用，如果質(zhì)粒早就長(zhǎng)出來了，都長(zhǎng)挺大了你的連接產(chǎn)物還沒動(dòng)靜呢，那八成是沒戲了，別等了趕快去準(zhǔn)備下次連接的材料。

       10. 切完回收的 vector 直接轉(zhuǎn)化對(duì)照。如果你是雙酶切，切完的 vector 和沒切的 vector 的長(zhǎng)度相差不大，或跑電泳這兩種跑不很開，就要做這個(gè)對(duì)照。目的是看切的是否徹底，是否還有環(huán)狀質(zhì)粒存在。長(zhǎng)不出克隆是對(duì)的，若長(zhǎng)出克隆，好好改進(jìn)你的酶切體系。

       11. 切完回收的 vector 加連接酶自身連接再轉(zhuǎn)化做對(duì)照。雙酶切的，最好要做這個(gè)對(duì)照，而且這個(gè)對(duì)照長(zhǎng)的克隆要挑若干提質(zhì)粒。
若切完的目的 vector 和沒切的 vector 的長(zhǎng)度相差較大，電泳條帶離的遠(yuǎn)，這個(gè)對(duì)照能檢測(cè)酶切和回收的質(zhì)量。如果 DNA 末端遭破壞或斷裂，會(huì)隨機(jī)產(chǎn)生各種末端，這些末端少數(shù)能連接到一起，長(zhǎng)度上小于等于回收的 vector。

       若切完的 vector 和沒切的 vector 的長(zhǎng)度相差不大，這個(gè)對(duì)照檢測(cè)是否有只進(jìn)行了單酶切的?？傊婚L(zhǎng)克隆或只長(zhǎng)很少是對(duì)的，長(zhǎng)多了還是去改進(jìn)上游的步驟。

（本文轉(zhuǎn)載丁香園）