一、毛細(xì)管電泳系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)
毛細(xì)管電泳系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu):包括進(jìn)樣系統(tǒng)、兩個(gè)緩沖液槽、高壓電源、檢測器、控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。
特點(diǎn):毛細(xì)管電泳通常使用內(nèi)徑為25-100 μm 的彈性(聚酰亞胺)涂層熔融石英管。標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管的外徑為375 μm,有些管的外徑為160 μm。毛細(xì)管的特點(diǎn)是:容積?。ㄒ桓?00 cm×75 μm 管子的容積僅4.4 μL);側(cè)面/截面積比大,因而散熱快、可承受高電場(100-1000 V/cm);可使用自由溶液、凝膠等為支持介質(zhì);在溶液介質(zhì)下能產(chǎn)生平面形狀的電滲流。
二、毛細(xì)管電泳優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn):
(1)高效塔板數(shù)目在105-106片/m間,當(dāng)采用CGE 時(shí),塔板數(shù)目可達(dá)107片/m以上;
(2)快速,一般在十幾分鐘內(nèi)完成分離;
(3)微量進(jìn)樣所需的樣品體積為nL級(jí);
(4)多模式可根據(jù)需要選用不同的分離模式且僅需一臺(tái)儀器;
(5)經(jīng)濟(jì)實(shí)驗(yàn)消耗不過幾毫升緩沖溶液,維持費(fèi)用很低;
(6)自動(dòng)CE是目前自動(dòng)化程度較高的分離方法。
缺點(diǎn):
(1)由于進(jìn)樣量少,因而制備能力差;
(2)由于毛細(xì)管直徑小,使光路太短,用一些檢測方法(如紫外吸收光譜法)時(shí),靈敏度較低;
(3)電滲會(huì)因樣品組成而變化,進(jìn)而影響分離重現(xiàn)性。
(毛細(xì)管電泳色譜結(jié)果圖)
三、實(shí)驗(yàn)操作簡介
1、提取樣本DNA
2、進(jìn)行DNA變性
3、進(jìn)行DNA雜交
4、進(jìn)行DNA延伸反應(yīng)
5、進(jìn)行PCR反應(yīng)
6、CE檢測流程:
(1)樣品排板、建立上機(jī)清單;
(2)4個(gè)樣本各取1μL到上機(jī)板;
(3)每孔加入9μL HiDi:Liz 500(體積比為250:1),離心、震蕩混勻、再離心;
(4)95℃變性5min,迅速降到4℃;
(5)上ABI3730XL全自動(dòng)DNA測序儀檢測。
拷貝數(shù)變異(CNV)是人類DNA遺傳變異的重要來源,在廣泛的疾病中發(fā)揮作用。運(yùn)用毛細(xì)管電泳色譜結(jié)合探針可確定一次多重PCR反應(yīng)中多達(dá)60個(gè)DNA序列的相對(duì)拷貝數(shù),這對(duì)DNA樣本中的缺失和重復(fù)辨識(shí)具有重要的研究意義。