細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存實(shí)驗(yàn)步驟:

     一、準(zhǔn)備
     無(wú)菌超凈臺(tái)，酒精燈，75%酒精噴壺，CO2培養(yǎng)箱，37℃水浴鍋，離心機(jī)；培養(yǎng)瓶，含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及PBS磷酸緩沖液（提前放置超凈臺(tái)使平衡到室溫），無(wú)菌工作服（白大褂），口罩，手套，記號(hào)筆
     二、步驟
     1、穿好無(wú)菌工作服，帶上口罩和手套，快速?gòu)囊旱锶〕鰞龃婀?，快速放進(jìn)37℃水浴鍋緩慢搖晃使細(xì)胞解凍，注意凍存管的封口膜不要破裂，防止污染。
     2、解凍后用紙擦干凍存管表面的水滴，酒精噴壺噴灑適量75%酒精消毒凍存管封口處。
     3、開超凈臺(tái)，點(diǎn)燃酒精燈燃燒片刻后（可提前準(zhǔn)備），凍存管放超凈臺(tái)，換新手套，小心打開凍存管，避免污染，無(wú)菌吸管將1ml細(xì)胞全部吸出至5ml無(wú)菌EP管，補(bǔ)加9ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋，1000rpm，離心5min使細(xì)胞沉淀，棄上清。
     4、加入新鮮配制的含10%血清的培養(yǎng)基4ml，輕輕混勻，用吸管將細(xì)胞移至25T培養(yǎng)瓶。
     5、平躺放置培養(yǎng)瓶，8字形混勻后，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
     6、培養(yǎng)24小時(shí)后，顯微鏡觀察細(xì)胞（貼壁細(xì)胞）貼壁后，小心更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶上標(biāo)記：操作者，時(shí)間，細(xì)胞類型。
     7、有的實(shí)驗(yàn)員的培養(yǎng)基會(huì)加入抗生素防止細(xì)胞污染，但是這對(duì)于掌握細(xì)胞培養(yǎng)是非常不利的，不加抗生素培養(yǎng)細(xì)胞更能提醒實(shí)驗(yàn)者無(wú)菌操作的意識(shí)。一旦細(xì)胞出現(xiàn)污染，易于發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)污染的細(xì)胞應(yīng)立刻煮沸丟棄，以免污染同實(shí)驗(yàn)室其他細(xì)胞。
     8、細(xì)胞長(zhǎng)滿90%-100%即可傳代，小心打開培養(yǎng)瓶，瓶口過酒精燈消毒，棄培養(yǎng)基。
     10、加入1mlPBS，潤(rùn)洗細(xì)胞，重復(fù)3次，棄PBS。
     11、加入4ml完全培養(yǎng)基，用無(wú)菌吸管小心吹打貼壁細(xì)胞或者用胰蛋白酶消化細(xì)胞使細(xì)胞脫落。
     12、轉(zhuǎn)移1/2脫落的細(xì)胞至新的培養(yǎng)瓶，各瓶補(bǔ)加完全培養(yǎng)基至4ml。
     13、小心封口，平躺放置培養(yǎng)瓶，8字形混勻后，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
     14、待長(zhǎng)滿后，按同樣的方法傳代培養(yǎng)。

     三、凍存
     當(dāng)不需要使用細(xì)胞或者細(xì)胞量足夠時(shí)，可以將細(xì)胞凍存起來(lái)，供以后實(shí)驗(yàn)用

     四、準(zhǔn)備
     細(xì)胞凍存液（20%血清、10%DMSO、70%基礎(chǔ)培養(yǎng)液），梯度降溫盒

五、步驟
     1、選取活力好，密度約70%細(xì)胞用于凍存，此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，最適合用于凍存。
     2、細(xì)胞吹打或者胰酶消化后，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌EP管，1000rpm里面5min。
     3、棄上清，加入新鮮配制的細(xì)胞凍存液，25T細(xì)胞可以加入2ml細(xì)胞凍存液，分裝2個(gè)凍存管，細(xì)胞最佳密度為5*106-1*107個(gè)每ml。
     4、做好標(biāo)記，放入梯度降溫盒（提前平衡至室溫）。
     5、將梯度降溫盒放入-80℃冰箱過夜，第二天取出凍存管，快速放入液氮保存。

     遵循“快速?gòu)?fù)蘇，緩慢凍存”的原則。