1. SP法      

      單克隆抗體MMP-2、MMP-9,SP試劑盒購自ZYMED公司(1 100)。3%H₂O₂封閉內(nèi)源性過氧化物酶,微波加熱抗原修復(fù), 10%正常羊血清孵育,滴加一抗, 4℃冰箱中過夜, PBS緩沖液(Na₂HPO₄ 8.1 mmol/L,KH₂PO₄1.5 mmol/L,NaCl 137mmol/L, 2.7 mmol/L pH 7.4)振蕩清洗后分別滴加二、三抗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)封片。

2. 雙層夾心ELISA法

       以純化后的多克隆抗體作為捕獲抗體，以本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)制備的抗LM Internalin A 單克隆抗體3R6為檢測抗體，建立雙抗夾心ELISA 方法。具體步驟如下：多克隆抗體稀釋液 →洗板3次→3% BSA封閉 →洗板3次→待測菌稀釋液 →洗板3次→單克隆抗體稀釋液 →洗板4次→酶標(biāo)羊抗鼠IgG →洗板5次→TMB顯色液 → 終止液→測定OD450值抗體、抗原和BSA 稀釋液均為0.01mol/L、pH7.4PBS。洗板液為含 0.1% Tween-20 的 0.01 mol/L、pH7.4PBS(PBST)。結(jié)果判定：以(測定孔 OD 值－空白對照孔OD 值)/(陰性對照孔 OD 值－空白對照孔 OD 值)≥ 2.1(即P/N ≥ 2.1)時判斷為陽性。

3.膠體金法

     ① 器皿洗滌準(zhǔn)備,將錐形瓶等實(shí)驗(yàn)所用的玻璃器皿放入由重鉻酸鉀和濃硫酸配制的酸液中浸泡 48 h，取出后用蒸餾水反復(fù)沖洗，并用超純水漂洗 3~4 次，烘干待用。

     ②膠體金的制備 膠體金熬制方法參照文獻(xiàn) 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，具體方法步驟如下：在含有 99 mL 超純水的干凈錐形瓶中加入 1 mL 1%氯金酸溶液，配制成 100 mL 0.01%氯金酸溶液；用恒溫電磁力攪拌器不斷攪拌加熱沸騰；氯金酸溶液煮沸后快速加入 1%檸檬酸三鈉并不斷攪拌，溶液顏色變成紫紅色后，繼續(xù)回流 10 min 后停止加熱，冷卻至室溫，存放 4 ℃冰箱備用。

     ③膠體金標(biāo)記抗克倫特羅單克隆抗體 膠體金標(biāo)記抗體制備金標(biāo)抗體探針的方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行：取適量熬制好的膠體金溶液至燒杯中，用 0.2 mol/L K₂CO₃溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液 pH 至6.0，超純水溶解抗體至膠體金 1/10 體積，并逐滴加入膠體金溶液，攪拌反應(yīng) 30 min（抗體標(biāo)記濃度分別為 0.5 μg/mL、1 μg/mL 以及 2 μg/mL），然后按膠體金 1/10 體積逐滴加入 10% BSA，攪拌封閉 30 min，繼續(xù)按膠體金 1/10體積逐滴加入 1% PEG 20000，攪拌封閉 30 min 后，9000 rpm 離心 30 min，吸去上清后加入原體積 1/10 的復(fù)溶液（含 1% BSA、2%蔗糖、0.05% PEG20000、0.1% NaN₃的 pH 7.4 0.02 mol/L 的磷酸鹽緩沖液）重懸金標(biāo)抗體。

     ④CLE 膠體金試紙條免疫反應(yīng)動力學(xué)分析  在陰性混合豬尿中添加 CLE 標(biāo)準(zhǔn)品至濃度分別為 0、0.2、0.5、1.0 ng/ml,分別取 70 μl加入試紙條加樣孔，膠體金讀數(shù)儀每隔 30S 測定試紙條 T、C線值以及 T/C 比值，跟蹤記錄加樣后 30 min。并以 T、C 線值以及 T/C 比值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，繪制動力學(xué)曲線，觀察試紙條 T、C 線值，T/C比值隨濃度和時間的變化。以動力學(xué)曲線變化間接反應(yīng)試紙條 T、C 線上抗原抗體免疫學(xué)反應(yīng)。

（本文轉(zhuǎn)載丁香園）