1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交細胞既可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開創(chuàng)了新紀元，也為臨床疾病的診斷、預(yù)防和治療提供了新的方法。

1. 雜交瘤的基本原理：

 雜交瘤技術(shù)又稱單克隆抗體技術(shù)(monoclonal antibody technique)。雜交瘤技術(shù)是使免疫動物的脾細胞在聚乙二醇（Polyethylene Glycol ，PEG）的誘導(dǎo)下與同系動物的骨髓瘤細胞融合。首先是細胞質(zhì)融合，然后通過有絲分裂細胞核合而為一，形成新的雜交細胞，簡稱為雜交瘤。細胞融合后移入HAT培養(yǎng)液中培養(yǎng)。骨髓瘤細胞由于缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGRPT），在HAT培養(yǎng)液中不能增殖而死亡。淋巴細胞培養(yǎng)中也不能長期在培養(yǎng)液中生長增殖。然而雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了HGPRT的基因產(chǎn)物，并從骨髓瘤細胞中獲得腫瘤細胞不斷生長繁殖（傳代）的特性，因此在HAT培養(yǎng)液中選擇性存活下來。細胞融合后既具有產(chǎn)生特異性抗體的能力。又保留了瘤細胞能體外長期培養(yǎng)的特性。

2. 雜交瘤細胞制備：
   （1）骨髓瘤細胞的培養(yǎng)：骨髓瘤細胞（NS-1或SP2/0）在含10～15的小牛血清完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)處于對數(shù)生長期時，此時細胞渾圓、透亮，大小均一，排列整齊，呈半致密分布。選擇處于旺盛生長，形態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞供融合用。
 
   （2）免疫小鼠：選用8～12周齡雌性BALC/C小鼠免疫。如抗原為可溶性（蛋白質(zhì)），可按每只鼠一次劑量為10～100μg/只免疫。蛋白質(zhì)抗原與等量弗氏完全佐劑充分混勻，分別注入鼠的頸背部多處或腹腔內(nèi)，間隔2～4周同法重復(fù)，經(jīng)1月后，再用10～100μg（0.1～0.2ml）抗原作靜脈或腹腔加強免疫。細胞與微生物表面抗原一般具有較高的免疫原性，可不加佐劑，直接經(jīng)腹腔或靜脈注入（1～2）×107細胞。一般采用融合前3～4d大劑量靜脈注入抗原，然后取脾做融合實驗。因此間脾臟B淋巴母細胞-漿細胞比例較高，融合率較高。
 
   （3）脾細胞制備：①放血處死小鼠，浸泡在75%的酒精中消毒。②在無菌條件下取脾，至含培養(yǎng)液的小平皿內(nèi)，去掉脂肪和結(jié)締組織，用5ml無血清培養(yǎng)液沖洗一次。③將脾細胞置細胞網(wǎng)上，加入5ml不完全培養(yǎng)液。用注射器內(nèi)芯研磨分散脾細胞，將脾細胞收集到離心管內(nèi)（50ml），加10～20ml培養(yǎng)液，離心（800～1000r／min，10min），棄上清后計數(shù)備用。
 
   （4）飼養(yǎng)細胞制備：在體外培養(yǎng)時，單個或少數(shù)分散的細胞不容易存活與繁殖，必須在加入其他活細胞才易存活與繁殖。通常在融合的前一天或當天用取小鼠腹腔巨噬細胞制作飼養(yǎng)層細胞。（5）細胞融合（雜交）

3.雜交瘤細胞瘤細胞的選擇性培養(yǎng)

   （1）培養(yǎng)：將融合后的細胞懸浮于HAT培養(yǎng)液中，置于含5%～7% CO2，37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
 
   （2）換液：每2～3天更換一半量的培養(yǎng)液一次，在融合兩周內(nèi)使用HAT培養(yǎng)液，在第12～13天用HT培養(yǎng)液，在第14天后根據(jù)細胞增殖情況改用15%～20%FCS完全培養(yǎng)液。
在停用A后，殘留于培養(yǎng)液或細胞內(nèi)的A仍起一定的阻抑作用，此時需繼續(xù)補加HT培養(yǎng)液，為雜交瘤細胞提供應(yīng)急的DNA合成途徑。
 
   （3）觀察：經(jīng)融合劑PEG處理后的細胞，凝集成粗顆粒狀。當天用倒置顯微鏡觀察，可見2～5個粘連骨髓瘤細胞，常有融合的巨細胞或啞鈴狀的細胞。

4. 雜交瘤細胞的篩選：

     融合后的細胞在HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)后，即有部分培養(yǎng)孔出現(xiàn)雜交瘤細胞集落，而其中僅部分是分泌預(yù)定特異性抗體的雜交瘤細胞。因此在培養(yǎng)7～10
d后用倒置顯微鏡觀察到雜交瘤細胞長成約占1/3～1/2視野時，即可取培養(yǎng)上清液進行特異性抗體的檢測，確定有無分泌單克隆抗體（monoclonal
antibody，McAb）的能力，以便及時進行細胞克隆化。檢測McAb的方法可根據(jù)情況進行選擇。
 

5. 雜交瘤細胞的克隆化：

    細胞融合成功后，并經(jīng)證實培養(yǎng)孔中存在預(yù)定抗原特異性抗體時，應(yīng)盡早將雜交瘤細胞克隆化，其目的是利用單個細胞培養(yǎng)技術(shù)，從細胞群體中選育出遺傳穩(wěn)定而同源的細胞系，以獲得分泌單一抗體的雜交瘤細胞系，淘汰遺傳不穩(wěn)定的雜交瘤細胞。每個雜交瘤細胞含有來自兩種親本細胞全套染色體，但在雜交瘤增殖過程中，將逐漸丟失染色體，甚而導(dǎo)致McAb產(chǎn)生能力的消失。因此，在篩選抗體陽性的雜交瘤細胞時，須盡早進行克隆化，以保持雜交瘤細胞具有同源的子代?？寺』嗖捎糜邢尴♂尫?。
 
   （1）先制備小鼠飼養(yǎng)細胞層，將細胞懸浮與HT（融合后第一次克隆化時）或含10%FCS -1640培養(yǎng)液中。
 
   （2）用滴管將抗體陽性待克隆化細胞孔輕輕吹吸，使細胞與孔底分離，用培養(yǎng)液將細胞懸液稀釋為每ml分別含5、10和50個細胞的懸液。
 
   （3）將上述稀釋的細胞懸液分別加入已培養(yǎng)有飼養(yǎng)細胞的24孔培養(yǎng)板中，每孔0.1ml（2滴），使相應(yīng)每孔分別含0.5、1或5個細胞。
 
   （4）將細胞培養(yǎng)板置于5%～7%CO2、37℃飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)，至第四天換培養(yǎng)液一次，第5～6天仔細觀察各孔內(nèi)細胞生長情況，并在相應(yīng)的孔蓋板上作標記，記錄克隆生長的情況。
 
   （5）特異性抗體的檢測：在克隆后的7～9天，在低倍鏡下如見到細胞克隆布滿1/3～1/2視野時，即可吸取培養(yǎng)上清液，用免疫學(xué)方法檢測相應(yīng)的抗體。如測出細胞生長孔含有特異性抗體，可選擇抗體效價高、呈單個克隆生長、形態(tài)良好的細胞孔，繼續(xù)同法再克隆擴大培養(yǎng)重復(fù)3次。如果有單克隆生長的每個孔內(nèi)的上清都能檢出高滴度抗體，則表明已經(jīng)實現(xiàn)“克隆化”。

6. 單克隆抗體腹水的制備：

    McAb因其具有高度特異性和能大量制備等特點，故生物試驗和醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。將雜交瘤細胞接種與同系小鼠或裸鼠腹腔內(nèi)，可誘生腫瘤和含McAb的腹水，并可有效保存雜交瘤細胞株和分離已經(jīng)污染雜菌的雜交瘤細胞株。
 
   （1）在接種瘤細胞1～2周前，先給小鼠腹腔注射液體石蠟油或降植烷0.5ml，同批小鼠預(yù)處理后可用2個月左右。
 
   （2）1周后每只小鼠腹腔注射5×105～5×106雜交瘤細胞。先洗滌一次，以營養(yǎng)液調(diào)其濃度。
 
   （3）注射雜交瘤8～10天后，小鼠腹部明顯脹大時，消毒小鼠腹部，用針頭刺入小鼠下腹部，并輕揉其腹部，慢慢抽出腹水。一次抽5～8ml，待2～3
d后，腹水積聚，用同法反復(fù)抽，一般可抽2～3次。腹腔內(nèi)產(chǎn)生腫瘤和腹水，抗體含量可達1 mg／ml。
 
   培養(yǎng)上清液中抗體含量低且混有大量血清蛋白，而腹水中雖然抗體含量高，但也混有蛋白，需進行純化及鑒定其特性。 

（本文轉(zhuǎn)載丁香園）