—— co-IP 檢測(cè) Hsp90 與 Cdc37 結(jié)合情況

1、實(shí)驗(yàn)材料

      SKBR3 細(xì)胞，PMSF（Amresco，cat:329-98-6），cocktail，脫脂奶粉（cat:66196131T），β-actin。Anti-Hsp90(santa,cat:sc-69703)、Anti-Cdc37(santa,cat:sc-13129)、Protein A+G agrose(Beyotime)，細(xì)胞刮，4 度離心機(jī)（eppendorf，centrifuge 5415R），搖床（ORBITAL SHAKER，TS-1000），電泳儀（Tanon EPS300）。低速離心機(jī)（cat:TDZ4B-WS）。

2、實(shí)驗(yàn)方法

制樣：

      ? 細(xì)胞裂解液配制：基礎(chǔ)裂解液中加入 PMSF，cocktail 和 DTT

      ? 實(shí)驗(yàn)分組：Control 組 、化合物 11（10μM）、化合物 11（20μM)、化合物 11（40μM），給藥時(shí)間 24 h。

      ? 棄培養(yǎng)上清，PBS 洗一遍，冰上加入 150ul/孔裂解液。

      ? 于冰上裂解30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)。

      ? 裂解完后，于 4℃ 下 12000rpm 離心 15 min。

      ? 收集蛋白上清，取少許裂解液用于后續(xù)檢測(cè)各蛋白表達(dá)情況。

      ? 剩余的裂解液加入 Anti-Cdc37，4℃ 緩慢搖晃孵育過(guò)夜。

      ? 用適量裂解緩沖液預(yù)處理 ProteinA+G，20uL/管加入各抗體孵育過(guò)夜的細(xì)胞裂解液中，4℃ 緩慢搖晃孵育 2~4 h。

      ? 免疫沉淀反應(yīng)后，4℃，3000rpm，3 min，小心吸取上清，瓊脂糖珠用 1 mL 
      ? 裂解液沖洗 3-4 次，最后加入 15uL 2*SDS 上樣緩沖液，100℃，5 min。

      ? Laemmli-SDS-PAGE

電泳：

      電泳時(shí)根據(jù)情況每塊膠 15mA 恒流電源；根據(jù)預(yù)染 Marker 和目的蛋白的分子量大小的相對(duì)位置判斷最佳跑膠時(shí)間，以使目的蛋白處于分離膠面的下 1/3 的最佳分辯位置。

轉(zhuǎn)膜：

      ? 將 PVDF 膜放到甲醇中浸泡 2 min

      ? 將轉(zhuǎn)膜夾打開(kāi)，在代表負(fù)極的黑色面鋪上一塊濕潤(rùn)的海綿墊，再添加 2 層濕潤(rùn)的濾紙，將 SDS-PAGE 膠小心地鋪在濾紙上，表面再覆蓋大小合適的 PVDF 膜；然后再覆蓋兩層濕潤(rùn)濾紙，再墊上濕潤(rùn)的海綿墊，將紅色的正極板合上，夾好，插入轉(zhuǎn)膜槽相應(yīng)的位置。

      ? 轉(zhuǎn)膜過(guò)程在 4℃ 進(jìn)行，采用 100V/100mA。

      ? 麗春紅染色：轉(zhuǎn)膜過(guò)程完成后，將膜從轉(zhuǎn)膜夾中取出，立即投入麗春紅染液中染色，大約染色 5 分鐘后將膜由麗春紅中取出，用清水輕輕沖洗膜，注意觀察膜上的紅色條帶，當(dāng)條帶足夠清晰后停止水洗，根據(jù)染色條帶把膜適當(dāng)剪小，留出目的蛋白所在的范圍。然后用清水徹底沖洗膜，盡可能洗去殘留的麗春紅，使得條帶消失。

封閉：

      一般抗體采用 5% 脫脂奶粉+TBST 封閉；封閉時(shí)間為室溫下一個(gè)小時(shí)，在搖床上進(jìn)行。

一抗雜交：

      在一個(gè) 1.5 ml 的 EP 管中加入 1 ml 的封閉液（5% 脫脂奶粉+TBST），再加入適量的一抗，置于 4℃ 冰箱中過(guò)夜。

洗膜：

      將過(guò)夜雜交的膜從塑料袋中取出，投入含有足量體積 TBST 的洗膜盒中，于搖床上清洗，每次 10 分鐘，連續(xù) 3 次。

二抗雜交：

      處理步驟類(lèi)似一抗雜交步驟，不同之處在于二抗雜交可在常溫下，1 小時(shí)內(nèi)完成。二抗比例控制在 1:2000～1:5000。

顯影：

      將膜平放于干燥的平面上，將新鮮配置好的 ECL Reagent 滴加到有鉛筆記號(hào)標(biāo)注的膜面上，反應(yīng) 5 分鐘后用濾紙?jiān)谀さ倪吘壉M量吸去多余的 ECL Reagent，將膜放到化學(xué)發(fā)光儀中收集信號(hào)。

（本文轉(zhuǎn)載丁香園）