免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabelling techniques）是指用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)（或生物）發(fā)光劑作為示蹤物，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)，借助于熒光顯微鏡、酶標(biāo)檢測儀等儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測定，可在細(xì)胞、亞細(xì)胞以及分子水平上，對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定性和定位研究；或應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對(duì)體液中的半抗原、抗原或抗體進(jìn)行定性定量測定。根據(jù)標(biāo)記物的種類和檢測方法不同，免疫標(biāo)記技術(shù)可分為酶免疫的技術(shù)（以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)為常用）、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、發(fā)光免疫測定技術(shù)等，本節(jié)主要介紹酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)以及免疫熒光技術(shù)。
　　

一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）
         酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合而發(fā)展起來的一種免疫標(biāo)記技術(shù)，既可用于組織、細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測，又可用于體液中抗原抗體的檢測。根據(jù)檢測方法的不同，可將酶聯(lián)法分為雙抗體夾心法、間接法、競爭法、捕獲法和其他ELISA，現(xiàn)介紹前三種。

    1.雙抗體夾心法　雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，將已知抗體包被于微孔條上，加入待檢品（抗原）形成抗原抗體復(fù)合物，加酶標(biāo)抗體與之結(jié)合，經(jīng)顯色后用酶標(biāo)儀測定OD值，從而測定相應(yīng)抗原含量。
      （1）以pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋已知抗體包被酶標(biāo)板，4℃過夜。市售商品往往已經(jīng)預(yù)先包被好已知抗體。
      （2）將酶標(biāo)板、試劑等平衡至室溫，分別于相應(yīng)孔內(nèi)加入待檢樣品、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照50μl。
      （3）分別在每孔內(nèi)滴加酶標(biāo)抗體50μl。置37℃溫育60min。室溫平衡5min，甩干孔內(nèi)液體，洗液洗滌5次，拍干。
      （4）每孔加顯色劑，37℃避光溫育10min。
      （5）每孔加終止液50μl，輕拍混勻。
      （6）酶標(biāo)儀測定OD值，用空白調(diào)零。樣本OD值/陰性OD值（S/N）≥2.1（同時(shí)待檢杯OD＞0．10）判為陽性。
 

         2. 間接法　間接法是檢測抗體最常用的方法， 將已知抗原吸附于固相載體，加待檢血清（抗體）形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)孵育、洗滌后，加酶標(biāo)抗體使之與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，經(jīng)顯色后用酶標(biāo)儀測定OD值，從而間接測定相應(yīng)抗體含量。步驟如下：
      （1）以pH 9.6碳酸鹽緩沖液稀釋已知抗原包被酶標(biāo)板，4℃過夜。市售商品往往已經(jīng)預(yù)先包被好已知抗原。
      （2）在預(yù)包被已知抗原酶標(biāo)板內(nèi)加入待檢樣品、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照50μl。置37℃溫育25～45 min。用洗液洗滌5次，拍干。
      （3）分別在每孔內(nèi)滴加酶標(biāo)抗體100 μl。置37℃溫育25～30min，洗滌。
      （4）每孔加顯色劑，輕拍混勻，37℃避光溫育10min。
      （5）每孔加終止液50μl。
      （6）酶標(biāo)儀測定OD值，用空白調(diào)零。樣本OD值/陰性OD值（S/N）≥2．1（同時(shí)待檢杯OD＞0．10）判為陽性。

          3. 競爭法　競爭法既可用于抗原半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以抗原競爭法為例，將已知抗體吸附于固相載體，加一定量已知酶標(biāo)抗原及待測抗原，使兩者競爭與固相抗體結(jié)合，經(jīng)洗滌，最后結(jié)合于固相抗體上的酶標(biāo)抗原與待測抗原含量呈負(fù)相關(guān)。步驟如下：
      （1）已知抗體包被酶標(biāo)板，4℃過夜。
      （2）測定管內(nèi)加一定量酶標(biāo)抗原和待檢樣品，對(duì)照管內(nèi)只加相同量酶標(biāo)抗原。溫育，洗滌。
      （3）分別于測定管、對(duì)照管內(nèi)加一定量底物顯色。
      （4）用酶標(biāo)儀測定對(duì)照管、測定管內(nèi)OD值，用空白調(diào)零。通過對(duì)照管與測定管OD值之差，計(jì)算標(biāo)本中待測抗原含量。
 

         進(jìn)行ELISA操作時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①實(shí)驗(yàn)室溫度應(yīng)控制在18℃～25℃；②加樣須準(zhǔn)確，同一樣本設(shè)立對(duì)照管、測定管各兩孔，取其平均值；③嚴(yán)格控制溫育反應(yīng)溫度及時(shí)間，洗滌應(yīng)充分；④結(jié)果判定應(yīng)以儀器為準(zhǔn)，肉眼僅作參考。
  

二、免疫熒光技術(shù)
          免疫熒光技術(shù)是將熒光素如異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)與相應(yīng)抗體（或抗原）以化學(xué)的方法結(jié)合，將熒光標(biāo)記抗體（或抗原）與標(biāo)本中相應(yīng)的抗原結(jié)合形成熒光標(biāo)記的抗體-抗原復(fù)合物，用熒光顯微鏡觀察。在鏡下見到有熒光存在即推斷有抗原抗體復(fù)合物的存在，根據(jù)已知的抗體（或抗原）即可推知另一個(gè)未知抗原（或抗體）的存在。

         1. 直接免疫熒光法　直接免疫熒光法是利用熒光色素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)的抗原結(jié)合，以鑒定未知抗原。本法具有操作簡單、時(shí)程短、特異性高的優(yōu)點(diǎn)，但也存在缺點(diǎn)如不能檢查抗體，敏感性較差。
      （1）在標(biāo)本上滴加熒光素標(biāo)記抗體，放入濕盒中。37℃溫育30min。 
      （2）PBS沖洗后，再用PBS分三缸浸泡，每缸3min。
      （3）PBS浸泡1～2min，風(fēng)干。
      （4）緩沖甘油封片。在熒光顯微鏡下觀察。
 

         進(jìn)行直接免疫熒光法時(shí)應(yīng)注意：①溫育時(shí)一定要將玻片放在濕盒中，以防液體蒸發(fā)。②用PBS浸泡時(shí)應(yīng)不斷振蕩。 
  

         2. 間接免疫熒光法　間接免疫熒光法以熒光素標(biāo)記抗球蛋白抗體，抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合后，熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體與已結(jié)合的抗體發(fā)生作用，從而推知抗原或抗體的存在。間接熒光技術(shù)可以用已知的抗原檢測未知的抗體，也可用已知的抗體測出未知抗原?，F(xiàn)以檢測流行性出血熱病毒抗體（IgM）為例介紹如下：
     （1）將待測病人血清加至抗原片（流行性出血熱病毒感染的Vero-E6細(xì)胞片）上，每個(gè)稀釋度加2孔，最后2孔加PBS做對(duì)照。將玻片放置濕盒中，37℃溫育60min。取出玻片，棄去反應(yīng)液，用PBS洗滌5min，風(fēng)干。
     （2）加入1∶40稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗人IgM，37℃溫育60min。取出玻片，按步驟2洗滌，風(fēng)干。
     （3）PBS甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。陽性結(jié)果：在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中可見顆粒狀熒光顆粒，細(xì)胞核呈紅色。
 

         注意事項(xiàng)：溫育時(shí)將玻片放在濕盒中，以防液體蒸發(fā)。選擇低溫、干燥、潔凈的環(huán)境風(fēng)干。

     （本文轉(zhuǎn)載丁香園）