Eli-spot 方法
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發(fā)布時間：2017-10-12
1 預(yù)期用途
Eli-spot分析是設(shè)計用于在單細胞懸液中計數(shù)分泌細胞因子的細胞數(shù)量的方法。這個方法的優(yōu)點在于只需在體外進行很少的處理從而使細胞因子產(chǎn)生的分析盡可能接近于體內(nèi)狀況。這個技術(shù)用于測定在給予一定刺激的情況下細胞因子產(chǎn)生細胞的數(shù)目，以及在某種處理或病理條件下的細胞因子產(chǎn)生細胞的數(shù)量。
2 主要原理
細胞刺激后，原位產(chǎn)生的細胞因子被一種特異的單抗捕獲，在細胞溶解后，捕獲的細胞因子與第二種生物素化的檢測性抗體結(jié)合，后者進一步通過與連接堿性磷酸酶的鏈親和素結(jié)合被識別。PVDF包被孔的板之后與BCIP/NBT底物作用，紫色的斑點提示單個細胞產(chǎn)生的細胞因子。
3 5×96孔試劑盒的內(nèi)容物
▲ 捕獲抗體（0.52ml），置于4℃。
▲ 生物素化檢測抗體（凍干，重懸于0.55ml水中）。
▲ 抗生物素蛋白鏈霉素-堿性磷酸酶結(jié)合物，置于4℃。
▲ 牛血清白蛋白（1g），置于4℃。
▲ 撇去的干牛奶（1g），放于室溫。
▲ 備用底物溶液（50ml），置于4℃。
▲ 96孔PVDF包被板。
▲ 96孔PVDF-包被板
▲ 細胞培養(yǎng)基
▲ CO2孵箱
▲ 70%乙醇
▲ Tween20
▲ 堿性磷酸鹽緩沖液
5 直接或間接Eli-spot
細胞可以在抗體包被孔中直接刺激（直接）或者首先在24孔板或細頸瓶中刺激，收獲，然后種于包被孔中（間接）。
方法根據(jù)：1）被分析的細胞類型；2）預(yù)期的細胞密度。如果細胞因子產(chǎn)生細胞的數(shù)量很少，建議用直接法實驗，但是如果細胞因子產(chǎn)生細胞的數(shù)量很多，最好用間接的方法。無論采用直接或間接的方法，所有刺激以后的步驟是相同的。
主要步驟：
1） 96孔PVDF板首先以70%乙醇處理，然后以捕獲抗體包被。
2） 將細胞放入抗體包被過的含有抗原/絲裂原的微孔中，在間接法中細胞被預(yù)刺激。
3） 細胞用倒置平板法去除，與生物素標(biāo)記的抗體共育。
4） 與結(jié)合于堿性磷酸鹽的鏈霉親和素反應(yīng)。
5） BCIP/NTB斑點形成。
◆刺激步驟：
小鼠脾細胞在PMA和lonomycin刺激下產(chǎn)生IFN-γ。人的IFN-γ由PBMC在PMA和lonomycin的刺激下產(chǎn)生。
建議步驟：
小鼠 1）分離脾細胞，ficoll。間期收獲細胞。用PBS洗三次，去除ficoll。2）用培養(yǎng)基稀釋細胞（RPMI1640含2mM L_glutamine,10%滅活的胎牛血清）含1ng/ml PMA和500ng/ml ionomycin(Sigma),加2×10（4）—5×10（4）細胞到抗體包被的PVDF包被板，在孵箱中培養(yǎng)10—15小時。對于其它刺激物孵育時間可能不同，根據(jù)細胞因子產(chǎn)生細胞的密度，優(yōu)化條件。
人用培養(yǎng)基稀釋細胞（RPMI1640含2mM L_glutamine,10%滅活的胎牛血清）含1ng/ml PMA和500ng/ml ionomycin(Sigma),加2×10（4）—5×10（4）細胞到抗體包被的PVDF包被板，在孵箱中培養(yǎng)10—15小時。對于其它刺激物孵育時間可能不同，根據(jù)細胞因子產(chǎn)生細胞的密度，優(yōu)化條件。
●試劑準備
● 檢測抗體 用0.55ml蒸餾水溶解凍干抗體，輕輕混勻溶液并等到所有凍干抗體溶解。
● 抗生物素蛋白鏈霉素-堿性磷酸酶 用含1%BSA的PBS稀釋（1/1000）
● 堿性磷酸鹽緩沖液（10×濃縮液）1L溶液：80g NaCL；2g KH2PO4; 14.4g Na2HPO42H2O; 2g KCL，加蒸餾水至1升。檢查PH在7.2-7.4之間，此溶液在用之前稀釋為1×溶液。
● 含2%脫脂干奶粉的PBS 一塊板溶0.2g 干粉于10ml 1×PBS。
● 含1%BSA的PBS一塊板溶0.2g 干粉于20ml 1×PBS。
● 含0.1%Tween 的PBS一塊板溶100μlTween20于100ml 1×PBS。
● 70%乙醇一塊板以3ml蒸餾水和7ml 乙醇混勻。
★試劑保存
1） 如果短時間內(nèi)不用，溶解的檢測抗體應(yīng)分裝和保存于—20℃，在這種條件下，試劑可穩(wěn)定保存至少一年。
2） 底物緩沖液保存于4℃。
3） 鏈霉親和素-堿性磷酸酶保存于4℃。
Eli-spot步驟
1 PVDF包被板用100ul 70%乙醇室溫下處理10分鐘。
2 倒空孔并以100ul PBS洗3次。
3 將100ul捕獲抗體加到10ml PBS中，混合并分至每孔中100ul，蓋上板蓋，放至4℃過夜。
4 倒空每孔，用100ul PBS洗一次。
5 每孔加100ul含2%脫脂干牛奶的PBS，蓋板，室溫2小時。
6 在洗滌槽上輕彈板子倒空液體，并在吸水紙上吸干。
7 用PBS洗一次。
8 分配每孔100ul細胞懸液（含合適的細胞數(shù)和合適的刺激物濃度），細胞可以在體外預(yù)刺激（間接Eli-spot）。蓋上板，放細胞于37℃CO2孵箱，合適的時間15-20小時。（在此期間不要搖動或平移平板。）
9 在洗滌槽上輕彈板子倒空液體，并在吸水紙上吸干。
10 每孔加100ul含0.1%Tween20的PBS，4℃放置10分鐘。
11 用含0.1%Tween20的PBS洗板三次。
12 每一塊板，稀釋100ul檢測抗體到10ml 含1%BSA的PBS中，每孔加100ul，封閉扳子放于37℃1小時30分鐘。
13 倒空扳子并用含0.1%Tween20的PBS洗三次。
14 每一塊板，稀釋10ul鏈霉親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物到10ml含1%BSA的PBS中，每孔加100ul，封閉扳子放于37℃1小時。
15 倒空，用含0.1%Tween20的PBS洗三遍，反復(fù)用吸水紙吸以去盡所有殘存的液體。
16 每孔加100ul備用BCIP/NBT溶液。
17 讓反應(yīng)在室溫進行5-20分鐘。肉眼可見小斑點形成。
18 用蒸餾水洗三次。
19 干燥每孔。計數(shù)斑點。注意斑點在4℃過夜后可能會變得明顯，放置扳子于室溫，避免直接光照。
（本文轉(zhuǎn)載丁香園）
