一、實驗目的：

  單克隆抗體制備是細胞免疫學的一個重要里程碑，它涵蓋了細胞培養(yǎng)、細胞融合、免疫動物和抗體效價檢測等各個方面內(nèi)容。了解單克隆抗體制備的原理、主要步驟和方法。

二、實驗原理：

  骨髓瘤細胞在體外培養(yǎng)能大量無限增殖，但不能分泌特異性抗體；而抗原免疫的B淋巴細胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無限增殖。將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合后形成的雜交瘤細胞，繼承了兩個親代細胞的特性，既具有骨髓瘤細胞能無限制增殖的特性，又具有免疫B細胞合成和分泌特異性抗體的能力。經(jīng)在HAT培養(yǎng)基[含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中進行選擇性培養(yǎng)，未融合的脾細胞因不能在體外長期存活而死亡；未融合的骨髓瘤細胞合成DNA的主要途徑被培養(yǎng)基中的氨基蝶呤阻斷，又因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤完成DNA的合成過程而死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。經(jīng)過克隆選擇，可篩選出能產(chǎn)生特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)，即可無限制地大量制備單克隆抗體。

三、試劑與器材：

  細胞培養(yǎng)板、解剖器械、平皿、酶標儀、加樣器、細胞計數(shù)板、CO₂培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡等。

四、操作方法：

  1、抗原制備；

  2、免疫動物；

  3、免疫脾細胞和骨髓瘤細胞的制備；

  4、細胞融合；

  5、雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)；

  6、雜交瘤細胞的篩選；

  7、雜交瘤細胞的克隆化；

  8、單克隆抗體的檢定；

  9、分泌單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立；

  10、單克隆抗體的大量制備。

五、關(guān)鍵步驟與注意事項：

  1、整個制備過程需嚴格無菌

  2、細胞傳代培養(yǎng)時注意適時更換培養(yǎng)液

  （本文轉(zhuǎn)載丁香園）