自身抗體診斷的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是間接免疫熒光法，其特點(diǎn)是特異性強(qiáng)，陽(yáng)性與陰性樣品的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比明顯，通過(guò)顯微鏡觀測(cè)能夠精確地判斷組織或細(xì)胞內(nèi)熒光的分布。自身抗原的位置決定了其相應(yīng)抗體的典型的熒光模式，所有與此典型模式不相關(guān)區(qū)域的染色被認(rèn)為是非特異性染色。即使偶爾伴有強(qiáng)的非特異性染色，但弱的特異性信號(hào)也能夠被識(shí)別。間接免疫熒光法不需要復(fù)雜、費(fèi)時(shí)的化學(xué)制備程序，而酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定等實(shí)驗(yàn)，要取得高特異性則必須提取和純化抗原，并將其吸附于固相載體上，如果抗原不純，則相關(guān)抗體會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。 

  間接免疫熒光法保留了原基質(zhì)的完整抗原譜，因而可同時(shí)檢測(cè)大量抗體．獲得較高的檢測(cè)效率。當(dāng)抗幾種不同抗原的抗體需要在一種生物基質(zhì)上同時(shí)檢測(cè)時(shí)(如抗細(xì)胞核抗原抗體)，或?yàn)槊恳环N實(shí)驗(yàn)逐一準(zhǔn)備抗原很困難或相當(dāng)復(fù)雜時(shí)，就應(yīng)該選擇免疫熒光法。另外，應(yīng)用免疫熒光法還可檢測(cè)到一些至今未知的抗體。

  在沒(méi)有熒光顯微鏡時(shí)，可嘗試用酶標(biāo)記的第二抗體代替熒光標(biāo)記的抗體，但是檢測(cè)的質(zhì)量會(huì)明顯下降。因?yàn)樵诿庖邿晒夥ㄖ校甘緞┤旧峭ㄟ^(guò)抗體直接結(jié)合在細(xì)胞抗原上產(chǎn)生的，而免疫酶法，染色則是彌散地圍繞在抗原周?chē)膮^(qū)域。因此免疫酶法并不總是像免疫熒光法那樣能區(qū)分抗原分布的細(xì)小差別。而且應(yīng)用酶染色時(shí)，會(huì)導(dǎo)致許多自身抗體不能被區(qū)分或根本測(cè)不到。僅應(yīng)用細(xì)胞核制備物免疫酶染色的純光度法評(píng)價(jià)也是不可取的，因?yàn)檫@不可避免地導(dǎo)致一些自身抗體被漏檢。 

  實(shí)驗(yàn)室工作者需要經(jīng)過(guò)一定的專業(yè)訓(xùn)練并不斷實(shí)踐，方可勝任熒光顯微鏡下的讀片工作。顯微鏡下的結(jié)果判斷，為綜合知識(shí)的體現(xiàn)，到目前為止，尚沒(méi)有任何儀器可取代人工讀片。 

  (一)實(shí)驗(yàn)基質(zhì)的選擇和血清的稀釋度 

  1．實(shí)驗(yàn)基質(zhì)的選擇用間接免疫熒光法對(duì)自身抗體進(jìn)行測(cè)定的效果，在很大程度上取決于基質(zhì)的質(zhì)量(包括基質(zhì)本身的質(zhì)量及制備的質(zhì)量)。這些實(shí)驗(yàn)基質(zhì)，通常是用動(dòng)物或人類的細(xì)胞或組織，經(jīng)一系列方法進(jìn)行處理，如Hep-2細(xì)胞的培養(yǎng)、吸附和固定，玲凍組織切片的制備、貼片等。國(guó)內(nèi)不少實(shí)驗(yàn)室仍在自制實(shí)驗(yàn)基質(zhì)，這已越來(lái)越不適應(yīng)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、現(xiàn)代化的需要，建議應(yīng)盡可能選擇生產(chǎn)工藝先進(jìn)、質(zhì)控措施嚴(yán)格的商品化試劑盒，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。檢測(cè)不同的自身抗體應(yīng)選擇不同來(lái)源的實(shí)驗(yàn)基質(zhì)(不同動(dòng)物的不同組織)。 

  2．血清的稀釋度　一般來(lái)講，一個(gè)待測(cè)標(biāo)本，要測(cè)定某種或多種自身抗體，通常需要先測(cè)定一個(gè)起始稀釋度。如該稀釋度的檢測(cè)結(jié)果為陰性，則認(rèn)為該抗體或多種抗體不顯著存在(無(wú)臨床價(jià)值)，通常無(wú)需稀釋標(biāo)本做進(jìn)一步檢測(cè)。如果該稀釋度的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則認(rèn)為該抗體明顯存在(可能有臨床意義)，可將標(biāo)本做進(jìn)一步稀釋，以獲得該抗體的滴度。因此確定待測(cè)標(biāo)本合適的起始稀釋度，顯得十分重要。由于待測(cè)血清的起始稀釋度是結(jié)合臨床統(tǒng)計(jì)所得，而不同的實(shí)驗(yàn)室采用的方法學(xué)有差異，故不同實(shí)驗(yàn)室的血清起始稀釋度可能不同。另外，為了避免前帶現(xiàn)象的發(fā)生，有時(shí)對(duì)可疑的陰性標(biāo)本，尚需進(jìn)一步的稀釋后進(jìn)行測(cè)定。 

  (二)實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化滴定平板技術(shù) 

  實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化流程為滴加樣品、標(biāo)記抗體至加樣板，然后將生物薄片載片蓋在加樣板表面的凹槽里，這時(shí)，載片上的所有生物薄片均與液滴接觸，反應(yīng)同時(shí)開(kāi)始。因?yàn)橐后w被局限在一封閉的空間，不再需要傳統(tǒng)“濕盒”，可同時(shí)在一致的反應(yīng)條件孵育大量的標(biāo)本。下面以間接免疫熒光法為例，介紹滴定平板技術(shù)的操作過(guò)程：

  1．準(zhǔn)備　檢查加樣板：觀察是否反應(yīng)區(qū)親水而周邊疏水，如果不是，用濕紙巾擦干凈，隨后從試劑盒中取出載片，等平衡至室溫時(shí)方可打開(kāi)包裝。注意不要觸摸生物薄片，用筆編號(hào)、標(biāo)記。 

  2．稀釋血清　根據(jù)使用者實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，用PBS-Tween緩沖液稀釋血清，每次實(shí)驗(yàn)均需陽(yáng)性、陰性對(duì)照，使用前要混勻。 

  3．加樣　按順序分別滴加25ul稀釋后血清至加樣板每一反應(yīng)區(qū)，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測(cè)標(biāo)本后再開(kāi)始溫育。 

  4．第一步溫育　將載片貼有基質(zhì)的一面朝下蓋在加樣板的凹糟里，反應(yīng)即開(kāi)始。室溫下溫育30分鐘。 

  5．沖洗　用燒杯盛PBS-Tween緩沖液流水沖洗載片1秒鐘(注意水流不要太急，不要直接對(duì)著基質(zhì))，然后立即將其浸入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯，浸洗至少1分鐘。 

  6．加樣滴加20ul異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗人球蛋白至一潔凈加樣板的反應(yīng)區(qū)，完全加完方可繼續(xù)溫育。異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗人球蛋白使用前需混勻，用PBS-Tween緩沖液稀釋。 

  7．第二步溫育從PBSTween緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內(nèi)用吸水紙擦干背面和邊緣后，立即蓋在加樣板上，注意不要擦拭反應(yīng)區(qū)。注意避免陽(yáng)光直接照射載片，室溫溫育30分鐘。 

  8．沖洗用燒杯盛PBS—Tween緩沖液流水沖載片1秒鐘(水流不要太急，不要直接對(duì)著基質(zhì))，然后立即將其浸入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少1分鐘。 

  9．封片加甘油／PBS至蓋玻片，每一反應(yīng)區(qū)約10ul。從pBS-Tween緩沖液取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應(yīng)區(qū)間鯨。將蓋玻片輕輕蓋在載片上。 

  10．結(jié)果判斷　熒光顯微鏡下觀察熒光。 

  (三)抗體檢測(cè)的質(zhì)量控制及注意事項(xiàng) 

  l．質(zhì)量控制　自身抗體檢測(cè)的質(zhì)量控制是用多種手段對(duì)自身抗體存在與否、濃度的多少進(jìn)行控制和評(píng)價(jià)，有利于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部、實(shí)驗(yàn)室之間對(duì)同一標(biāo)本獲取相同具有可比性的結(jié)果，是衡量實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平的一個(gè)重要指標(biāo)。然而．自身抗體檢測(cè)的質(zhì)量控制，并不是一件容易的工作。因?yàn)椴煌瑢?shí)驗(yàn)室所用的抗原基質(zhì)存在差異、抗原的固定方法有差異或不同，血清的稀釋方法不同以及操作者對(duì)不同熒光模式的識(shí)別能力不同等，均可影響到自身抗體的檢酒質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行臨床檢測(cè)時(shí)，應(yīng)同時(shí)檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照，以監(jiān)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。國(guó)內(nèi)急需成立專門(mén)的學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)，參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，與國(guó)際接軌，建立自己當(dāng)?shù)氐臉?biāo)準(zhǔn)，開(kāi)展自身抗體檢測(cè)的質(zhì)量控制。 

  2．實(shí)驗(yàn)結(jié)果的進(jìn)一步確認(rèn)(兩級(jí)測(cè)定)　間接免疫熒光法，提供了對(duì)自身抗體進(jìn)行篩選的理想途徑。許多情況下，僅使用該方法就可為臨床提供足夠的診斷信息，不需要做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。在自身抗體的檢測(cè)中，稱間接免疫熒光法為“水平1測(cè)定”。如果有必要對(duì)自身抗體進(jìn)行進(jìn)一步的單特異性區(qū)分，則可應(yīng)用其他方法，如酶免疫測(cè)定法、對(duì)流免疫電泳及免疫雙擴(kuò)散法等，稱這些實(shí)驗(yàn)為“水平2測(cè)定。酶免疫測(cè)定法所用的抗原必須為純化的。許多抗原不易被純化，且很多自身抗體的確切抗原至今未知。故目前只有一小部分用HEp-2細(xì)胞柱測(cè)到的抗體及小部分組織抗體，進(jìn)行進(jìn)一步單特異性檢測(cè)。然而抗體的最終區(qū)分，需要使用純化的抗原作為實(shí)驗(yàn)基質(zhì)。單獨(dú)的“水平2”測(cè)定，不能適應(yīng)自身抗體檢測(cè)的需要。特別是對(duì)抗核抗體的測(cè)定，單做“水平2”測(cè)定將會(huì)漏掉某些自身抗體，故必須同時(shí)用免疫熒光法進(jìn)行檢測(cè)。 

  3．實(shí)驗(yàn)報(bào)告及解釋 

  (1)陰性：在整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)(包括各種質(zhì)控)正常的情況下，當(dāng)待檢標(biāo)本在合適的起始稀釋度下，實(shí)驗(yàn)基質(zhì)沒(méi)有明顯的熒光染色，或沒(méi)有可辨認(rèn)的熒光模型時(shí)，稱此待檢的血清樣本的某種自身抗體陰性。

  (2)陽(yáng)性：整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)(包括各種質(zhì)控)正常的情況下，當(dāng)血清待檢標(biāo)本在合適的起始稀釋度下，產(chǎn)生明顯高于陰性對(duì)照的特異熒光，且有明鮮可以辨認(rèn)的熒光模式，稱此待檢血清標(biāo)本的某待檢抗體陽(yáng)性。

  (3)免疫熒光模式；對(duì)陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)報(bào)告其熒光模式，以初步提供自身抗體針對(duì)的靶抗原特異性，為進(jìn)一步進(jìn)行“水平2”檢測(cè)提供信息。

  (4)滴度：滴度的定義為：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清比較，能觀測(cè)到的特異性的熒光反應(yīng)的最高稀釋度。檢測(cè)結(jié)果應(yīng)該報(bào)告滴度，為臨床提供動(dòng)態(tài)的信息，因?yàn)樽陨砜贵w陽(yáng)性患者，在診斷和治療過(guò)程中，要做多次檢測(cè)，且有些自身抗體的滴度與病情密切相關(guān)。

 （本文轉(zhuǎn)載丁香園）