Overview：

      Other names：p35; IL12-A; CLMF1; NFSK; NKSF1; Natural Killer Cell Stimulatory Factor 1; Cytotoxic Lymphocyte Maturation Factor 1; NF Cell Stimulatory Factor Chain 1Function:Cytokine that can act as a growth factor for activated T and NK cells, enhance the lytic activity of NK/lymphokine-activated Killer cells, and stimulate the production of IFN-gamma by resting PBMC.

Sequence：

      MCPLRSLLLI STLVLLHHLP HLSLGRSLPT TTASPGRSCL DYSQNLLRAVSNTLQKARQT LEFYSCTSEE IDHEDITKDK TSTVEACLPL ELATNESCLASRETSFITNG HCLASGKTSF MTTLCLRSIY EDLKMYHVEF QAMNAKLLMDPKRQIFLDQN MLAAIAELMQ ALNFDSETVP QKPSLKELDF YKTKVKLCILLHAFRIRAVT IDRMMSYLSS S

2, Features

      DL-IL12A-Ra

      大鼠白介素 12A （IL12A） 酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒

預(yù)期應(yīng)用

      本試劑盒運(yùn)用雙抗體夾心 ELISA 法定量測定大鼠血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體中 IL12A 含量。

標(biāo)本的采集與保存

1. 血清：

      將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置 2 小時(shí)或 4℃ 過夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃ 或-80℃ 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2. 血漿：

      用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的 30 分鐘內(nèi)于 2-8℃ 1000×g 離心 15 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃ 或-80℃ 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3. 組織勻漿：

      1）取適量組織塊，于預(yù)冷 PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；

      2）可同時(shí)選用多種勻漿方法達(dá)到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入 5-10 mL 預(yù)冷 PBS 進(jìn)行充分研磨，該過程需在冰上進(jìn)行（有條件實(shí)驗(yàn)室可選用機(jī)器勻漿）；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復(fù)凍融 進(jìn)一步處理（超聲破碎過程中注意冰浴降溫；反復(fù)凍融法可重復(fù) 2 次）。

      3）將制備好的勻漿液于 5000×g 離心 5 分鐘，留取上清即可檢測。

4. 細(xì)胞裂解液：

      1）貼壁細(xì)胞需要先用胰酶消化，離心收集細(xì)胞（懸浮細(xì)胞可直接離心收集）；

      2）將收集到的細(xì)胞用冷 PBS 洗 3 次；
      3）物理方法裂解細(xì)胞（可先超聲破碎細(xì)胞，再反復(fù)凍融）：

      i 超聲破碎：取適量 PBS 重懸細(xì)胞，用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂。

      ii 反復(fù)凍融：將待破碎的細(xì)胞在-20℃ 以下冰凍，室溫融解，反復(fù) 3 次，使細(xì)胞溶脹破碎。

      4）將標(biāo)本于 2-8℃ 1500×g 離心 10 分鐘，收集上清備用。

      5. 細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它生物標(biāo)本：

      請 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?-20℃ 或 -80℃ 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注意：

      1. 以上標(biāo)本均需密封保存，4℃ 保存應(yīng)小于 1 周，-20℃ 不應(yīng)超過 1 個(gè)月，-80℃ 不應(yīng)超過 2 個(gè)月。

      2. 標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。

      3. 標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

試劑準(zhǔn)備

      1. 使用前將所有的試劑和標(biāo)本緩慢均衡至室溫 （18-25℃），試劑不能直接在 37℃ 溶解。

      2. 標(biāo)準(zhǔn)品 （凍干品）：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1 mL，蓋好后室溫靜置大約 10 分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為 1000pg/mL。準(zhǔn)備 7 個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的 EP 管，每個(gè) EP 管中加入 500μL 的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋成 1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mL，15.6pg/mL，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 （0pg/mL） 直接作為空白孔。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

      3. 檢測溶液 A 及檢測溶液 B：Detection A 及 Detection B 在使用前請手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測稀釋液 A 或 B1:100 稀釋 （如：10μL 檢測溶液 A/990μL 檢測稀釋液 A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制 （100μL/孔），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制 0.1-0.2 mL。

      4. 濃洗滌液：用 580 mL 蒸餾水或去離子水將 20 mL 濃洗滌液稀釋至 600 mL，進(jìn)行 30 倍稀釋。

      5. 底物溶液：請用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的 TMB 至另一干凈容器中使用，容器中剩余的底物應(yīng)予丟棄，不要倒回 TMB 瓶中。

注意：

      1、 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋不能直接在板中進(jìn)行。

      2、 標(biāo)準(zhǔn)品請于臨用前 15 分鐘內(nèi)配制。該標(biāo)準(zhǔn)品只能使用一次。

      3、 標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液 A 工作液、檢測溶液 B 工作液請使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆?；靹驎r(shí)要輕輕充分混勻，避免起泡。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確請使用微量吸管，并校準(zhǔn)微量加液器。請依據(jù)所需的量精確配制，盡量不要微量配制 （如吸取檢測溶液 A 時(shí)，一次不要小于 10μL），以避免造成濃度誤差。

      4、 請勿重復(fù)使用已經(jīng)稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液 A 工作液和檢測溶液 B 工作液。

      5、 濃洗滌液中如有結(jié)晶析出，請先溫育至室溫，輕輕混勻，至到結(jié)晶完全溶解再進(jìn)行配制。

      6、 試劑盒中部分試劑為儲存液，客戶需配置成工作液后使用，在配置過程中如因純凈水質(zhì)量差或水質(zhì)污染，以及實(shí)驗(yàn)中所用耗材潔凈度差，可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至完全錯誤，請使用雙蒸水。

操作步驟

      1.加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔 7 孔，依次加入 100μL 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 （見試劑準(zhǔn)備 2）?？瞻卓准?100μL（見試劑準(zhǔn)備第二步最后一管），余孔加待測樣品 100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃ 溫育 2 小時(shí)。

      2.棄去液體，甩干，不用洗滌。

      3.每孔加檢測溶液 A 工作液 100μL（臨用前配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37℃ 溫育 1 小時(shí)。

      4.棄去孔內(nèi)液體，每孔用 300μL 的洗滌液洗滌，浸泡 1-2 分鐘，吸去 （不可觸及板壁） 或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次 （也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干），重復(fù)洗板 3 次。最后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。自動洗板機(jī)亦可。

      5.每孔加檢測溶液 B 工作液 （臨用前配制）100μL，加上覆膜，37℃ 溫育 1 小時(shí)。

      6.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 4。

      7.每孔加底物溶液 90μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃ 避光顯色 （反應(yīng)時(shí)間控制在 15-25 分鐘，不要超過 30 分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前 3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后 3-4 孔梯度不明顯時(shí)，即可終止）。

      8.每孔加終止溶液 50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。

      9.在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長測量各孔的光密度 （O.D. 值）。


注意：

      1.試劑準(zhǔn)備：準(zhǔn)備一次實(shí)驗(yàn)所需要的酶標(biāo)條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。

      2.加樣：實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時(shí)注意不要有氣泡，將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時(shí)，第一個(gè)孔與最后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的「預(yù)溫育」時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。因此，一次加樣時(shí)間 （包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品） 最好控制在 10 分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

      3.溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)請將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)，同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

      4.洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí) 驗(yàn)過程中。

      5.反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化 （比如，每隔 10 分鐘觀察一次），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

      6.底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

      7.如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)濕度低于 60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。

實(shí)驗(yàn)原理

      將 IL12A 抗體包被于 96 孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本，其中的 IL12A 與連接于固相載體上的抗體結(jié)合，然后加入生物素化的 IL12A 抗體，將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后，加入 HRP 標(biāo)記的親和素，再次徹底洗滌后加入 TMB 底物顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 IL12A 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度 （O.D. 值），計(jì)算樣品濃度。

典型數(shù)據(jù)

      為了便于計(jì)算，盡管濃度為自變量而 O.D. 值為因變量，我們繪圖時(shí)仍采用標(biāo)準(zhǔn)品的 O.D. 值作為橫坐標(biāo) （X 軸），標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo) （Y 軸）。同時(shí)為了試驗(yàn)結(jié)果的直觀性，圖中提供的是原始數(shù)據(jù)而非對數(shù)值。推薦使用對數(shù) 值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。由于實(shí)驗(yàn)操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和溫度條件等），標(biāo)準(zhǔn)曲線的 O.D. 值會有所差異。所提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需要根據(jù)自已的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

檢測范圍

      15.625pg/mL-1000pg/mL

最低檢測限

      6.1pg/mL

      此值為 20 個(gè)空白樣品 （即標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液） 測定的平均值加二倍標(biāo)準(zhǔn)差所對應(yīng)的濃度。

特異性

      本試劑盒用于檢測 IL12A，經(jīng)檢測與其它相似物質(zhì)無明顯交叉反應(yīng)。

      由于受到技術(shù)及樣本來源的限制，不可能完成對所有相關(guān)或相似物質(zhì)交叉反應(yīng)檢測，因此本試劑盒有可能與未經(jīng)檢測的其它物質(zhì)有交叉反應(yīng)。

穩(wěn)定性

      經(jīng)測定，試劑盒在有效期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性降低率小于 5%。

      為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來進(jìn)行操作可減少人為誤差。

   （本文轉(zhuǎn)載丁香園）