酶聯(lián)免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶促反應(yīng)的專一性和敏感性結(jié)合而形成的一種方法。這是一種固相酶免疫檢測(cè)技術(shù)，始創(chuàng)于1971年。它既可用于測(cè)定抗原，又可用于測(cè)定抗體。其敏感性高，特異性強(qiáng)，已成為酶免疫技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的一種方法。本實(shí)驗(yàn)以雙抗夾心法檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）為例。

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      通過本實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)，了解酶聯(lián)免疫吸附的基本原理及其用途，并熟悉其操作步驟與技能。

【實(shí)驗(yàn)原理】

      酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將酶（如辣根過氧化物酶，HRP）標(biāo)記到抗體或抗原分子上，利用微孔塑料反應(yīng)板能吸附蛋白質(zhì)的特性，將可溶性抗原或抗體吸附于反應(yīng)孔表面，然后用酶標(biāo)記的抗體或抗原與其特異性結(jié)合，洗去游離抗原或抗體，最后加入酶作用底物。由于酶分解底物而顯色，根據(jù)底物顏色深淺來判斷標(biāo)本中特異性抗原或抗體的量。

【試劑與器材】

      1. 待測(cè)抗原、抗體（馬抗HBsAg）和酶標(biāo)記抗體(HRP-抗HBsAg)。

      2. 正常人血清和陽性對(duì)照血清。

      3. 包被緩沖液(0.05M  pH9.6碳酸鹽緩沖液)。

      Ｎa2CO3     1.59g

      NaHCO3      2.93g

      加蒸餾水至1000ml

      4. 洗滌緩沖液(0.15M  pH7.4  PBS加0.05% Tween-20)。

      5. 底物緩沖液。

      0.1mol/L檸檬酸（2.1g/100ml）6.1ml

      0.2mol/L Na2HPO4·12H2O（7.163g/100ml）6.4mL

      加入12.5ml蒸餾水，將10mgOPD溶于其中，待溶解后，臨用前加３０％Ｈ２Ｏ。

      6. 終止液(2M H2SO4）。

      7. 加樣器、微孔板、酶標(biāo)檢測(cè)儀。

【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】

      1. 包被：用0.05M pH9.6 碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，于吸水紙上扣干水分。

      2. 加樣：加待測(cè)抗原0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1h。然后洗滌3次，扣干水分。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔)。

      3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體0.1ml。37℃ 孵育0.5～1h，洗滌。

      4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的OPD底物溶液0.1ml，37℃ 10～30min。

      5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入0.05ml終止液。

       6. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可在酶標(biāo)檢測(cè)儀上，于492nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽性。

【注意事項(xiàng)】

      1. 試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

      2. 洗滌時(shí)確保洗滌干凈，避免假陽性。

【思 考 題】

      1. 在對(duì)流免疫電泳中為什么抗體會(huì)向陰極移動(dòng)？

      2. 酶聯(lián)免疫吸附法有哪幾種類型，其原理是什么？

    （本文轉(zhuǎn)載百度文庫(kù)）