非酒精性脂肪性肝病是一種肝臟中儲(chǔ)存過多脂肪的疾病。這種脂肪堆積不是由于大量飲酒引起的，當(dāng)大量飲酒導(dǎo)致肝臟脂肪堆積時(shí)，這種情況稱為酒精性肝病。NAFLD有兩種類型：?jiǎn)渭冃灾靖魏头蔷凭灾拘愿窝祝∟ASH，nonalcoholic steatohepatitis）。NASH是世界范圍內(nèi)肝臟疾病最重要的原因之一，在發(fā)達(dá)國家已成為最常見的肝臟疾病，在發(fā)展中國家的發(fā)病率也逐年上升。

　　2019年稱為“Year of NASH”，有4家制藥公司的NASH候選藥物進(jìn)入III期臨床開發(fā)階段，有近百種藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段（Clinical trials）。截止目前，也沒有批準(zhǔn)的有效的NASH治療藥物和方案。FDA在一份指導(dǎo)文件中表示，NASH治療成功、纖維化改善或者兩者結(jié)合是潛在的批準(zhǔn)NASH療法的可接受終點(diǎn)。盡管如此，哪個(gè)終點(diǎn)以及哪種藥物在該領(lǐng)域最早證明有用，仍沒有公認(rèn)結(jié)果。

　　導(dǎo)致NASH的主要危險(xiǎn)因素包括肥胖、II型糖尿病、血脂異常和代謝綜合征等。NASH除了肝臟脂肪變性，還包括膨脹、炎癥和纖維化。在NASH中后期，炎癥和肝細(xì)胞損傷可導(dǎo)致肝纖維化或瘢痕形成，可以進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化或肝癌。根據(jù)這些特點(diǎn)，動(dòng)物模型研發(fā)近些年也取得了較大的進(jìn)展，特別在纖維化（Liver fibrosis），并最終發(fā)展到肝癌（Hepatocellular carcinoma）階段。肝纖維化是指反復(fù)或長期的損傷或炎癥導(dǎo)致肝臟內(nèi)大量瘢痕（scar，纖維化）組織積聚。雖然一些動(dòng)物研究顯示了肝臟自我再生或自我愈合的潛力，但一旦人類的肝臟受損，肝臟通常不會(huì)愈合。然而，藥物和生活方式的改變有助于防止纖維化惡化，且可以用小鼠模型來進(jìn)行臨床前評(píng)價(jià)。肝纖維化常參考的指標(biāo)是人的肝臟纖維化METAVIR 評(píng)分系統(tǒng)（METAVIR scoring system,見圖1），將纖維化分為4級(jí)[1]。纖維化階段從F0到F4：F0：無纖維化；F1：無間隔門脈纖維化；F2：門脈纖維化伴少量間隔；F3：大量間隔，無肝硬化；F4：肝硬化。

　　NASH小鼠模型可以分為4類：（1）日糧誘導(dǎo)模型，（2）化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)模型，（3）基因編輯模型，（4）前面2種，或者3種方法結(jié)合在一起的綜合模型，這類模型的優(yōu)點(diǎn)是疾病模型的病理特征最典型和全面。由于纖維化改善是潛在的批準(zhǔn)NASH療法的可接受終點(diǎn)，因而本文重點(diǎn)介紹一下纖維化模型。

　　1. 日糧誘導(dǎo)模型

　　采用高脂、高糖、和/或高膽固醇飼料，或者M(jìn)CD（蛋氨酸膽堿缺乏飼料），可以成功誘導(dǎo)肥胖，或者營養(yǎng)缺乏的NASH模型（詳見表1）[2]。比如對(duì)于C57BL/6小鼠，采用Research Diets公司 的D12492飼料（高脂飼料，60%脂肪供能），可以誘導(dǎo)肥胖，基本沒有纖維化。采用D09100310飼料（NASH飼料，替代FDA禁止使用含反式脂肪酸的飼料AMLN DIET，40%脂肪供能，主要是棕櫚油、20 %果糖和2%膽固醇），12~16周誘導(dǎo)出脂肪變性；20~26周誘導(dǎo)出炎性小體；26~34周誘導(dǎo)出纖維化。日糧誘導(dǎo)型NASH模型的特點(diǎn)是，模擬了肥胖、II型糖尿病、血脂異常和代謝綜合征等特征，但小鼠肝纖維化比較弱，基本上不會(huì)發(fā)生HCC。在日糧誘導(dǎo)模型中，添加高比例的果糖、葡萄糖和膽固醇，小鼠的肝纖維化可以達(dá)到F2級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（moderate中度纖維化），是目前應(yīng)用較多的一種臨床前小鼠NASH模型。

　　2. 化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)模型

　　化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的肝損傷和肝纖維化很常見，已用于小鼠肝臟纖維化模型的構(gòu)建，這類模型發(fā)展到肝硬化和肝癌的幾率也很高[2]。常用的誘導(dǎo)物有，四氯化碳（CCL4）、硫代乙酰胺（TAA）和鏈脲菌素（STZ）等。CCL4和TAA常用于成年鼠，STZ用于新生鼠。CCl4和TAA的毒性機(jī)制尚不完全清楚，但涉及肝細(xì)胞對(duì)CCl4和TAA的攝取和轉(zhuǎn)化，代謝產(chǎn)物引起氧化性壞死炎癥的反應(yīng)和分泌膠原蛋白的細(xì)胞的過度活化和增殖。用特定背景的新生小鼠，結(jié)合高脂日糧和STZ誘導(dǎo)，可以建立“STAM”小鼠模型，其8周表現(xiàn)出NASH的特征，12周出現(xiàn)纖維化，最終接近100%的雄鼠表現(xiàn)出HCC[3].

　　3. 基因編輯模型

　　與代謝相關(guān)的基因，或者表達(dá)對(duì)肝臟細(xì)胞有損害作用的蛋白，科研工作者研發(fā)了許多NASH基因編輯模型（見綜述[2]）。這里簡(jiǎn)介3種NASH基因編輯模型，結(jié)合高脂飲食，可以更快和更高比例的獲得NASH模型，纖維化特征明顯。低密度脂蛋白受體（Ldlr）基因家族，由參與特定配體受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用的細(xì)胞表面蛋白組成。Ldlr KO小鼠血清膽固醇水平，是野生小鼠的2~4倍。結(jié)合高脂（HFD-fed）飼喂LDLR ko小鼠，可以誘導(dǎo)以肥胖、高膽固醇血癥為特征的代謝綜合征、高甘油三酯血癥和胰島素抵抗癥狀；類似于人NASH模型為特征的模型[4]。

　　Mc4r（黑皮質(zhì)素4受體）是一種蛋白質(zhì)編碼基因。Mc4r 純合敲除小鼠在6~8周時(shí)，體重高達(dá)30g，表現(xiàn)出明顯的肥胖。結(jié)合高脂（HFD-fed）飼喂Mc4r KO小鼠，更容易表現(xiàn)出肝脂肪變性、肝纖維化和肝細(xì)胞癌，類似于人NASH模型為特征的模型 [5]。

　　尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，uPA)，在細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程中發(fā)揮重要作用。uPA對(duì)肝細(xì)胞有毒性，會(huì)引起肝損傷。最早在1992年Sandgren等就做出了Alb-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠，用來研究肝癌。不過由于uPA的肝毒性，Alb-uPA小鼠在出生4天就會(huì)出現(xiàn)溶血癥狀，最終會(huì)大部分死亡。2000年Weglarz等作了改進(jìn)[6]，做出了MUP-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠，使用MUP增強(qiáng)子/啟動(dòng)子在肝細(xì)胞中特異性表達(dá)uPA， 用來研究肝細(xì)胞移植。與Alb-uPA類似，由于基因丟失，uPA的表達(dá)會(huì)逐漸降低；不同的是MUP-uPA小鼠要到2-4周之后才會(huì)開始表達(dá)uPA，從而降低新生小鼠的死亡率。2017年在Nature發(fā)表了重磅研究[7]，將MUP-uPA小鼠，通過10代回交到了C57BL/6背景，飼喂高脂高糖飲食(WD-SW)，3個(gè)月表現(xiàn)出典型的NASH病變，如肝脂肪變性，脂肪性肝炎（包括ballooning hepatocytes and Mallory-Denk bodies），在6~11個(gè)月后，90%的小鼠出現(xiàn)HCC。從RNA-seq和組化數(shù)據(jù)證明，該模型是目前報(bào)道的最好的模擬人類NASH和HCC的模型。

　　由于NASH的病因廣泛，公認(rèn)是一種異質(zhì)性的疾病，因而也為模型的選擇帶來了困難。緩解纖維化作為潛在的批準(zhǔn)NASH療法的可接受終點(diǎn)，使得動(dòng)物模型中的纖維化指標(biāo)變得更為重要。