目的:供體的短缺是器官移植所面臨的主要問題,制備人源化器官是解決此問題的有效途徑之一? 缺乏延胡索酸乙酰乙酸水解酶會引起遺傳性酪氨酸血癥Ⅰ型,致使患者肝細胞凋亡,呈現(xiàn)出肝損傷? 對豬(Sus scrofa)進行基因編輯,建立FAH 基因敲 除巴馬小型豬,結合人干細胞將有利于人源化干細胞肝的制備? 本研究在α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除巴馬小型豬的基礎上,通過 CRISPR/Cas9 技術制備 FAH 基因敲除小型豬,并分析其健康與繁育狀況?

　　方法:針對豬 FAH 基因設計單鏈導向 RNA (single guide RNA, sgRNA)構建pX330表達載體轉(zhuǎn)染巴馬小型豬耳成纖維細胞(ear fibroblasts of Bama minipigs,BMEF)并進行敲除效 率驗證,鑒定后選擇陽性細胞作為核供體,通過體細胞核移植技術制備 FAH 基因敲除巴馬小型豬? 提取仔豬的基 因組DNA,經(jīng)PCR測序后得到突變類型;采集5月齡 FAH+/-巴馬小型豬血液,檢測其血生化與血常規(guī)指標并觀察 肝組織學染色切片;當 FAH+/-巴馬小型豬公豬性成熟后,與野生型(wildtype,WT)母豬配種,以其產(chǎn)仔數(shù)評價繁育 能力狀況?

　　結果:得到了 FAH+/-巴馬小型豬,Westernblot顯示 FAH+/-巴馬小型豬的肝和腎中FAH的表達量均有 所下降;FAH+/-豬與野生型相比,FAH+/-豬血液理化指標無顯著差異;組織學切片染色發(fā)現(xiàn) FAH+/-豬肝組織形態(tài)出 現(xiàn)空泡樣變化;與 FAH+/-公豬配種的野生母豬產(chǎn)仔數(shù)正常;FAH+/-豬具有正常的健康狀況和繁育能力?

　　結論:本 研究制備出了 FAH 單基因敲除小型豬,健康狀況及繁育能力正常,該單基因敲除豬為將來制備出雙等位基因敲除 豬與人源化肝的研究提供了良好基礎?