CRISPR/Cas9的現(xiàn)狀如何呢？距離建 立高效的CRISPR/Cas9基因編輯技術還有哪些路要走？
復旦大學生命科學學院王永明研究員，他是這么認為的：
CRISPR/Cas9技術是2013年發(fā)展起來的基因編輯技術，被認為是繼鋅指酶(ZFN)、TALEN之后的第三代基因編輯技術。CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括兩個元件，分別是Cas9內(nèi)切酶和guide RNA(gRNA)，gRNA引導Cas9蛋白在靶位點進行切割，形成 DNA雙鏈斷裂(DSB)。細胞的修復系統(tǒng)修復雙鏈斷裂的DNA時，會定點產(chǎn)生突變，這就是基因編輯。如果想改變不同的位點，只需要表達相應的gRNA就行了。細胞修復DNA主要依靠兩種途徑，分別是非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HR）。非同源末端連接是高效的修復途徑，修復系統(tǒng)對DNA末端做簡單的修飾后重新連接在一起。這個過程經(jīng)常會產(chǎn)生堿基的插入或缺失（indel），如果indel發(fā)生在編碼區(qū)，就有可能造成移碼突變，使基因失去功能，這種方法用于敲除基因。研究人員通常將表達Cas9和gRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到感興趣的細胞中來制作基因敲除的細胞模型。在轉(zhuǎn)染效率高的細胞系如HEK293中，編輯效率一般在10-30%左右。有的細胞轉(zhuǎn)染效率低，編輯效率也低，如在人的胚胎干細胞中編輯效率為1-25%。這時可以通過流式細胞分選儀將轉(zhuǎn)染成功的細胞分選出來提高效率。我們最近利用附著體載體表達Cas9和gRNA，同時表達嘌呤霉素抗性基因，既可以長期編輯細胞，又可以富集轉(zhuǎn)染成功的細胞，這是目前最高效的基因編輯技術，這種方法只適合于基因的敲除，在胚胎干細胞中效率最高可達到100%。
同源重組途徑需要提供一個同源模板供體，可以是質(zhì)粒或者單鏈DNA。DNA雙鏈斷裂處把供體遺傳信息拷貝過來修復基因，這種方法的優(yōu)點是可以精確的改變DNA序列，缺點是效率低。如何提高同源重組是基因編輯領域的一個重大挑戰(zhàn)。利用質(zhì)粒當作供體，同時加上一個篩選基因，這種方法的效率還是非常高的，但是制作供體工作量大，編輯后還要去除篩選基因，整個實驗周期長。這種方法顯然無法用于基因治療，因為質(zhì)粒供體無法導入體內(nèi)細胞中。短的單鏈DNA oligo也可以做供體，合成DNA oligo成本低，速度快，同源重組后不存在去除篩選基因的步驟。但是這種方法重組效率很低，除了幾種容易轉(zhuǎn)染的細胞，在大多數(shù)細胞中難以檢測到編輯成功的細胞。有幾篇文章報道他們通過加小分子化合物或者優(yōu)化oligo的設計方案得到了很好的編輯效率，但是我們的實驗結(jié)果表明效率依然不理想。同源重組效率和編輯位點所處的基因組位置有很大的關系，有的位點容易發(fā)生同源重組，有的不容易。調(diào)控DNA修復途徑可能會提高同源重組，但是目前提高的效果有限，調(diào)控DNA修復途徑還會增加基因組突變的風險。所以如何提高同源重組還有很長的路要走。
基因編輯已經(jīng)應用到多個領域，吸引了很多的優(yōu)秀人才開始嘗試將基因編輯技術應用于人類各個行業(yè)的發(fā)展。針對CRISPR的局限，剪切導致的脫靶以及只能利用病毒載體運送DNA，現(xiàn)在有什么可行的解決方法么
脫靶剪切是大家都關注的一個問題，脫靶剪切的原因是基因組中有很多和靶向序列非常相似的序列，這些序列容易被識別切割從而產(chǎn)生突變，如果這些序列有功能的話，會引發(fā)疾病?？茖W家已經(jīng)發(fā)明了一些降低脫靶的技術，一個是double-nicking技術，就是在Cas9上引入一個點突變，使得Cas9只能切斷DNA雙鏈中的一個鏈，同時表達兩個gRNA，在DNA雙鏈上分別產(chǎn)生一次切割，形成雙鏈斷裂，這就降低了脫靶。還有一種方法是在Cas9上引入幾個突變，降低Cas9蛋白和DNA的非特異性結(jié)合，也可以有效的提高脫靶切割。這些技術在降低脫靶的同時，也降低了編輯效率。實際上，如果設計的gRNA序列在基因組中非常特異的話，脫靶效率是非常低的。包括我們在內(nèi)的數(shù)個實驗室通過實驗均表明在干細胞中很難檢測到脫靶。之前的幾個課題組在研究脫靶時，選用的gRNA在基因組中都有非常相似的序列，這就造成了脫靶效率高的現(xiàn)象。在做基因治療時，突變拷貝和正?？截愅挥幸粋€堿基的差異，這時候確實存在很高的脫靶，需要謹慎編輯。在體內(nèi)進行基因編輯治療時，目前最有效的方法是利用病毒載體將CRISPR/Cas9系統(tǒng)導入細胞內(nèi)。AAV病毒能夠組織特異性的感染細胞，免疫排斥反應小，最具有治療前景。一部分科學家在發(fā)明用化學試劑轉(zhuǎn)染體內(nèi)細胞，這種方法除了要克服轉(zhuǎn)染效率低的問題，還要克服對細胞毒性大的問題。
