實驗原理：

MTT法是Mosmann 1983年報道的，以后此方法得到了迅速發(fā)展并廣泛應用于臨床與科研研究。其原理是活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值。

實驗材料： 細胞樣本

試劑、試劑盒：PBS  DMSO  胰蛋白酶   甘氨酸緩沖液    二甲亞楓

儀器、耗材：加樣器96孔培養(yǎng)板酶標儀培養(yǎng)板

實驗步驟：

二、貼壁細胞

1.  收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100 ul，鋪板使待測細胞調(diào)密度至1 000-10 000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2.  5% CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個梯度，每孔100 ul，設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況。

3.  5% CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

4.  每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

5.  終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。

6.  每孔加入150 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

7.  同時設置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）

三、懸浮細胞

（4）細胞懸液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100 ul 1640）。

2.  置37℃，5% CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

3.  每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）

4.  離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。 

四、MTT的配制

MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4oC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。

配制MTT時用用PBS溶解，也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。

1.  PBS配方

（1）NaCl ：8 g。

（2）KCl 0.2：g。

（3）Na2HPO4 ：1.44 g。

（4）KH2PO4：0.24 g。

（5）調(diào)pH7.4。

（6）定容1 L。

五、細胞的接種（鋪板）

細胞過了30代以后就不要用了，因為狀態(tài)不好了；培養(yǎng)板要用好的（最好進口板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。

接種時最好按照預實驗摸索出的密度接種， 因為細胞密度在10000/ml左右時，所測得的OD值的區(qū)間即細胞抑制率（或者增值率）的所呈現(xiàn)的線性關系最好，結(jié)果最可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會很明顯，太密細胞可能都會凋亡，因為細胞長的太快營養(yǎng)會不夠，最后導致死亡。

且而細胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關系不佳。故而MTT細胞密度多采用10000/ml，100 ul/孔。

（本文轉(zhuǎn)載丁香通）