注意事項(xiàng)：

1.  選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。

2.  避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

3.  設(shè)空白對照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。

MTT實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時(shí)候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計(jì)算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50％抑制率時(shí)候的藥品濃度，就是IC50。要點(diǎn)：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點(diǎn)線圖即可！

舉個(gè)例子：

IC50=0.00025

參考公式：

公式中的最大最小陽性反應(yīng)率就是最大最小抑制率

例：

1.  選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。

2.  避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

3.  設(shè)空白對照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。

MTT實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時(shí)候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計(jì)算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50％抑制率時(shí)候的藥品濃度，就是IC50。要點(diǎn)：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點(diǎn)線圖即可！

舉個(gè)例子：

IC50=0.00025

參考公式：

公式中的最大最小陽性反應(yīng)率就是最大最小抑制率

例：

用96孔板培養(yǎng)SMMC-7721肝癌做MTT測細(xì)胞活力，應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基，多少M(fèi)TT和DMSO合適根據(jù)書上說的加200 ul 1640，20 u lMTT，150 ul DMSO加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測定，一般每孔4000個(gè)細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在20000個(gè)/ml，MTT加20 ul，作用四小時(shí)后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150 ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。

一、經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

1.  首先細(xì)胞的接種密度一定不能過大，一般每孔1000個(gè)左右就夠了，我認(rèn)為寧少勿多。尤其是對于腫瘤細(xì)胞。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現(xiàn)不出的，最佳點(diǎn)板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會很大。

2.  MTT本身就是比較粗的實(shí)驗(yàn)，增殖率10%左右的波動(dòng)都不算奇怪。特別是新手，20%的波動(dòng)也是常見的，所以很可能是技術(shù)原因引起的，特別是種板技術(shù)一定要過關(guān)。

3.  我做的是腫瘤細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)，這種細(xì)胞長的很快一開始我是用100000/ML的濃度來接種的，結(jié)果細(xì)胞長的太滿結(jié)果是沒有梯度也沒有線性關(guān)系.后來調(diào)整濃度，用過40000~80000/ML的濃度都做過MTT實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)做的結(jié)果比較好點(diǎn)的是60000~70000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組，由于細(xì)胞少，藥物作用的梯度還是有，只是沒有很好的線性關(guān)系.還有根據(jù)細(xì)胞生長速度以及藥物的特性（有時(shí)間依賴性和濃度依賴性的藥物）來確定培養(yǎng)時(shí)間是48小時(shí)還是72小時(shí).

4.  注意細(xì)胞懸液一定要混勻，已避免細(xì)胞沉淀下來，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不等，可以每接幾個(gè)就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多，但是如果操作不熟，CV會在8%左右。另外，吹散次數(shù)過多也會影響細(xì)胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。

二、實(shí)驗(yàn)心得分享

5.  向每孔中用槍頭加入細(xì)胞時(shí)不要太快，否則你會發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在加入的瞬間會由于槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周邊很少，這種不均勻的分散會產(chǎn)生接觸抑制，影響細(xì)胞的生長。所以速度不能太快也不能太慢。我習(xí)慣每塊板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回復(fù)3下移動(dòng)，目的是使得細(xì)胞能分散的均勻些。（鋪板技術(shù)是MTT實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，也是基礎(chǔ)，一定要練好。曾經(jīng)有同學(xué)用漩渦振蕩器混勻細(xì)胞，最后細(xì)胞全死了，建議不要采用這種方法混勻細(xì)胞。

（本文轉(zhuǎn)載丁香通）