目的:構建特異性抑制大鼠Raf-1基因的重組腺病毒載體,體外轉導大鼠心肌細胞進行功能鑒定。
方法:合成大鼠Raf-1的靶序列和陰性對照序列,將退火后的DNA雙鏈定向克隆到穿梭質粒pAdTrackCMV中,得到pAdTrack-siRaf-1質粒。 pAdEasy-1 骨架質粒是同源的。重組pAd-siRaf-1質粒,轉染HEK293細胞,包裝得到pAd-siRaf-1腺病毒顆粒,感染原代培養(yǎng)的心肌細胞。蛋白質印跡用于檢測針對af 的 siRNA。 .-1、用于測量NF-κB基因抑制效率、3H-亮氨酸([3H]-leu)攝取率的液體閃爍計數(shù)器,用于測量細胞表面積的HJ2000圖像分析系統(tǒng)。
結果:重組腺病毒載體被正確消化鑒定,制備的病毒感染效率高。攜帶af-1 的病毒顆??捎行б种芶f-1 表達、細胞表面積和 AngII 誘導的 [3H] 蛋白水平心肌細胞。 ] -Leu 增加和下調af-1 和F-κB 的表達。
結論:pAd-siRaf-1重組腺病毒載體構建成功,包裝在HEK293細胞重組腺病毒中。轉染心肌細胞后,可有效抑制Raf-1和NF-κB的表達,抑制心肌誘導。由于AngⅡ細胞肥大。