背景：硬腦膜動靜脈瘺（DAVF）是一種異常的連接動脈和腦膜靜脈或硬膜靜脈竇或皮質(zhì)靜脈。是一種顱內(nèi)血管畸形。硬腦膜動靜脈瘺約占顱內(nèi)血管畸形的10-15%，幕上動靜脈畸形6%和幕下動靜脈畸形的35%。硬腦膜動靜脈瘺可發(fā)生在任何部位，但這些血管畸形最常見于海綿竇、橫竇、乙狀竇及上矢狀竇（SSS）。DAVF的治療形式主要是血管內(nèi)栓塞治療。DAVF的原因尚未明確。有先天和后天的原因。有一種觀點認為，硬腦膜動靜脈瘺是一種顱內(nèi)動靜脈畸形和硬腦膜血管異常引起的先天性疾病。已經(jīng)有很多臨床試驗表明，硬腦膜動靜脈瘺的形成可能是造成腦外傷，靜脈竇炎癥、靜脈竇血栓形成、顱內(nèi)腫瘤、腦手術(shù)、高凝狀態(tài)、血液分子異常等，DAVF是一種獲得性血管疾病。認為獲得性DAVF是由于DAVF和靜脈竇血栓形成之間的關(guān)系較為密切。許多研究者建立了大鼠靜脈竇高壓模型頸總動脈頸外靜脈吻合（CCA-EJV）方法。1）高靜脈竇壓力可能誘發(fā)DAVF；2）自動排除大靜脈竇壓力后DAVF消失；3）術(shù)后28 d，高壓組靜脈壓明顯升高；4）靜脈竇血栓形成是高靜脈竇壓的危險因素。有利于DAVF形成關(guān)鍵點是顱內(nèi)靜脈竇壓增高。有兩種理論解釋：一是開放的"生理動靜脈吻合"，另一種是"血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)的硬腦膜血管生成。"本研究的目的是通過使用兔模型誘導(dǎo)形成的高顱內(nèi)靜脈壓調(diào)查更詳細的DAVF形成機制。本研究采用cca-pfv吻合產(chǎn)生高顱內(nèi)靜脈壓模型，成功誘導(dǎo)DAVF形成，首次發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子在兔模型中的表達。

　　方法：實驗動物：該研究經(jīng)過福利倫理委員會的批準。100只日本大耳雄兔（體重2.0~2.5 kg）。

　　麻醉：通過注入1%戊巴比妥鈉（25毫克/公斤）到耳靜脈（EV）進行麻醉誘導(dǎo)，包括動靜脈吻合，頸動脈放置導(dǎo)管，收獲標本。百分之一戊巴比妥鈉經(jīng)導(dǎo)管注入頸動脈進行腦血管造影。

　　動物準備：實驗動物分組：五十只雄性日本長耳兔隨機分為五組，A -E. A組（對照組）假手術(shù)（n = 10）。B組實行右側(cè)頸總動脈（CCA）-面后靜脈（PFV）端端吻合術(shù)(EEA) （n = 10）。C組實行右側(cè)頸總動脈（CCA）-面后靜脈（PFV）加左側(cè)頸外靜脈（EJV）（n = 10）。D組實行右側(cè)頸總動脈-面后靜脈cca-pfv端側(cè)吻合（ESA）（n = 10）。E組實行右側(cè)右側(cè)頸總動脈-面后靜脈cca-pfv端側(cè)吻合加左側(cè)頸外靜脈（EJV）結(jié)扎（n = 10）。術(shù)后7、14、90天各組隨機抽取2只兔，墨汁灌注后計數(shù)硬腦膜微血管數(shù)。術(shù)后90天，每組選取4只兔進行數(shù)字減影心血管造影術(shù)冰觀察DAVF的形成。

　　另取五十只日本大耳白兔隨機分為五組，A -E組。A組（對照組）假手術(shù)（n = 10）。B-E組（n = 40）實行右側(cè)頸總動脈（CCA）-面后靜脈（PFV）端端吻合術(shù)(EEA)加左側(cè)頸外靜脈（EJV）結(jié)扎。

　　在B、C、D、E組（n=10）分別于術(shù)后1周、2周、三周、術(shù)后第90天取標本進行進一步免疫組化（每組6只）和蛋白印跡分析（每組4只）。

　　模型制備：手術(shù)前動物禁食10小時，不限制飲水。1%戊巴比妥鈉（25毫克/千克）被注入到左耳靜脈EV。麻醉后將兔固定在手術(shù)臺上。頸部去毛并用碘伏消毒，皮膚切口在頸部。以下步驟在顯微鏡下進行。

　　1、 A組：解剖分離出雙側(cè)頸外靜脈。近端是在前、后面部靜脈和頸外靜脈交叉前部1cm結(jié)扎，遠端是前、后面部靜脈和頸外靜脈交叉后部1cm結(jié)扎。暴露右側(cè)頸動脈三角，鈍性分離2厘米的CCA。24 #靜脈（IV）導(dǎo)管分別穿刺入面后靜脈（PFV）和CCA，并與侵入式壓力測量儀器相連，測量CCA和PFV實驗壓力。局部應(yīng)用少量青霉素后縫合切口。

　　2、 B組分離出雙側(cè)頸外靜脈和右側(cè)CCA（長度等于假手術(shù)組）。測定正常的動脈壓和PFV壓力。右側(cè)頸外靜脈的前端被結(jié)扎（前面部靜脈和后前面部靜脈和頸外靜脈的交界處0.5厘米）。前面靜脈遠端（AFV）也被結(jié)扎。用血管夾夾住PFV，面后靜脈（PFV）與頸外靜脈交叉處前約3cm處切斷。CCA的近端被截斷，遠端被結(jié)扎和切斷，血管的內(nèi)腔用1毫克/毫升肝素/生理鹽水溶液洗滌。CCA和PFA的殘余部分用亞甲藍染色，然后用1毫克/毫升肝素/生理鹽水洗滌。端到端的CCA和PFV吻合用9-0縫線進行。吻合術(shù)后進行吻合口通暢驗證。測量吻合后的PFV壓力，和切口使用少量青霉素后縫合傷口。

　　3、 C組  分離出右側(cè)CCA、EJV和左側(cè)EJV。左側(cè)EJV用4-0縫合結(jié)扎。其他操作同B組。

　　4、 D組 分離出雙側(cè)頸外靜脈與右側(cè)CCA（分離長度與假手術(shù)組相同）。測定正常的動脈壓和PFV壓力。對右側(cè)EJV的前段和AFV的遠端進行結(jié)扎。夾住PFV，在PFV和EJV交叉處約3mm的地方切斷。血管腔用1毫克/毫升肝素/生理鹽水洗滌。使用兩個血管夾來夾住CCA，兩個剪輯之間的距離是約1.5厘米。用微剪刀沿容器壁切入，切口長度為管徑的1.5倍長。血管的內(nèi)腔用1毫克/毫升肝素/生理鹽水溶液洗滌。CCA的切口和PFV殘段用亞甲基藍染色并用1毫克/毫升/肝素生理鹽水溶液沖洗。頸總動脈與PFV之間用9-0縫線進行端側(cè)吻合。對吻合口通暢進行驗證。測量吻合后的PFV壓力，切口使用少量青霉素后縫合。

　　5、 E組：分離出右側(cè)CCA、EJV和左側(cè)EJV。左側(cè)EJV用4-0縫線結(jié)扎。其他操作同D組。

　　測量壓力：將5組共50只兔的右側(cè)頸總動脈（CCA）剝離出來，并測量CCA壓力。

　　頸總動脈血壓測量：剝離CCA約2cm，24#IV導(dǎo)管從尾部插入，用血管夾固定，并連接無創(chuàng)血壓測量裝置。在心臟水平，壓力調(diào)整到零。在讀數(shù)穩(wěn)定后，進行拍攝和記錄。

　　面后靜脈壓力測量：將5組共50只兔的面后靜脈（PFV）剝離出來，并測量PFV壓力。剝離右側(cè)頸外靜脈、面前靜脈和面后靜脈的總長度約2cm。將24#IV導(dǎo)管通過靜脈瓣膜插入PFV，固定后與侵入式壓力測量儀相連。在心臟水平，壓力調(diào)整到零。在讀數(shù)穩(wěn)定后，進行拍攝和記錄。

　　吻合術(shù)后面部靜脈壓力的測量：B-E組的40只兔子，在測量PFV壓力和剖殺之前驗證cca-pfv吻合術(shù)后吻合口通暢。將24#IV導(dǎo)管通過靜脈瓣膜插入PFV，固定后與侵入式壓力測量儀相連。在心臟水平，壓力調(diào)整到零。在讀數(shù)穩(wěn)定后，進行拍攝和記錄。

　　墨汁灌注：從B-E組做完CCA-PFV吻合術(shù)后的第7、14、90天和A組每組選取2只兔進行投頸部墨汁灌注。計數(shù)硬腦膜微血管密度。

　　DSA檢查：術(shù)后90天，從五組中每組選取4只兔頭頸部進行DSA檢查。具體程序如下：

　　導(dǎo)管放置在頸動脈：經(jīng)過耳靜脈注射1%戊巴比妥鈉（25mg/kg）麻醉動物，將家兔置于仰臥位并固定在手術(shù)臺。沿原頸切口進行解剖。右動靜脈吻合部位仔細解剖。周圍有許多新的靜脈形成。經(jīng)驗證吻合口通暢后，測量術(shù)后面部靜脈壓。固定吻合部位。剝離左CCA，并放置24G靜脈導(dǎo)管。導(dǎo)管充滿1毫克/毫升肝素，閉合頸部切口。

　　獲取DSA圖像：通過CCA注射1%戊巴比妥鈉，將家兔置于仰臥位并固定于DSA桌。調(diào)整機器的位置，iohexol-300是通過放置在CCA造影導(dǎo)管注射（2ml/s，3ml）。拍攝前后X線片。

　　免疫組化：從對照組、7天、14天、21天和90天組，每組6只兔采集枕葉皮質(zhì)和硬腦膜標本進行HIF-1α和VEGF免疫組化。枕葉皮層的選擇，因為該區(qū)首先受吻合影響產(chǎn)生顱內(nèi)高壓且其能較方便地進行試驗。將免疫組化切片組織，福爾馬林固定后石蠟包埋，切片用蘇木精和曙紅（HE）染色。組織切片與下列主要抗體孵育：血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）（C）（1∶100），缺氧誘導(dǎo)因子- 1α（1∶200）4°C孵育過夜。然后用辣根過氧化物酶標記小鼠抗兔二抗體孵育（1:1000）。免疫組織化學分析用的3,3'- Diaminobenzidine（DAB）方法進行。所有標本在倒置顯微鏡和Olympus BX51照相系統(tǒng)下觀察。百分比為陽性細胞數(shù)目除以總細胞數(shù)。用于表達水平分配數(shù)值的標準如下：-=0% ，+ = > 0% - 25%，+ +=26% - 50%，+ + +=51% - 75%，+ + + + = > 75%。

　　Western印跡法：從對照組、7天、14天、21天和90天組，每組4只兔采集枕葉皮質(zhì)和硬腦膜標本進行免疫印跡。用RIPA緩沖液裂解標本，由Bradford法測定蛋白質(zhì)提取物的濃度。40μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到10%  PVDF膜，在含0.1%吐溫20和5%脫脂奶粉的TBS溶液中孵育。然后膜用特異性血管內(nèi)皮生長因子VEGF（C-1）一抗（1:200），HIF-1α一抗（1:200），和α微管蛋白（分子量為52 kDa，1:3000）在4°C孵育過夜。膜用辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔抗體孵育（1:1000）。使用增強的化學發(fā)光辣根過氧化物酶底物觀察免疫反應(yīng)帶。結(jié)果代表三個獨立的實驗。定量分析是由GE圖像掃描儀Quantity One軟件進行。

　　結(jié)果：B組和C組動物術(shù)后均存活。由于顱內(nèi)靜脈壓過高，D組和E組各2只兔術(shù)后3 d內(nèi)死亡。吻合口通暢率B組的為80%，C組為90%，D組為60%，E組為50%。

　　圍手術(shù)期血壓：術(shù)后B-E組吻合口通暢的頻率無顯著差異。假手術(shù)組（A組）術(shù)后靜脈血壓與基線比較差異無統(tǒng)計學意義。B-E組動物手術(shù)后和處死前，靜脈壓力同基線相比顯著增加。術(shù)后及處死前與對照組比較，術(shù)后靜脈血壓明顯升高。B組和C組動物的靜脈血壓明顯高于D組和E組。B組與C組、D組與E組間差異無統(tǒng)計學意義。

　　腦墨汁灌注：對硬腦膜血管微血管由凸矢狀竇寬2毫米和3毫米以上的橫竇進行觀察和比較。硬腦膜毛細血管計數(shù)為微血管/每平方毫米數(shù)。對照組硬腦膜微血管計數(shù)為12±2平方毫米，術(shù)后14天計數(shù)為15±2平方毫米，略有增加。90天后，腦膜微血管計數(shù)明顯增加， B，C，D，和E組分別為36±4平方毫米，39±5平方毫米，33±3平方毫米，35±4平方毫米。

　　DSA檢查：手術(shù)后90天A-E組每組抽取4只進行 DSA檢查。動脈期DSA圖像如圖4所示，靜脈期如圖5所示。在A組，血管通暢，無異常的血管，血液循環(huán)的時間約為11-15 S。在B，C，D和E組，耳朵和眼睛區(qū)域觀察到血管迂曲、硬腦膜動靜脈瘺和AVF。在一些動物中，觀察到兩個或兩個以上的動靜脈瘺。在16只兔中觀察到22例動靜脈瘺。其中，7例為DAVFs，因此DAVF形成率為43.75%（7 / 16）。DAVFs主要位于SSS、海綿竇、橫竇。DAVFs通過SSS、橫竇、面后靜脈被排出；眼睛動靜脈瘺經(jīng)前面部靜脈引流；耳動靜脈瘺鏡面后靜脈引流，頸動靜脈瘺通過面后靜脈引流。在B，C，D和E組循環(huán)時間延長（大約32-40S）。靜脈期的循環(huán)時間明顯延長，而在動脈期則沒有明顯延長（約5 s）。

　　免疫組化法檢測VEGF和HIF-1α的表達水平：1周和2周組的枕葉皮層和血管內(nèi)皮細胞VEGF表達顯著高于對照組、3周和90天組。與對照組相比，2周組動物SSS中VEGF表達水平明顯升高。與對照組和2周、3周、90天組比較，1周組在枕葉皮質(zhì)、軟腦膜血管及SSS中均有較高的HIF-1α表達。

　　Western blot分析VEGF和HIF-1α的表達水平：枕葉硬腦膜VEGF表達水平和枕葉皮質(zhì)及SSS區(qū)HIF-1α表達水平相似。表達峰值出現(xiàn)在1周，其次是2周、3周、第90天和對照組。枕葉硬腦膜VEGF表達在對照組，1周，2周，3周，和90天的平均表達水平分別為10.1，27.2，34.1，16.9和11.8。枕葉皮質(zhì)HIF-1α在對照組，1周，2周，3周，和90天的平均表達水平分別為9.1，35.6，24.7，20.5，10.1。SSS區(qū)HIF-1α在對照組，1周，2周，3周，和90天的平均表達水平分別為9.4, 35.6, 26.7, 17.7, 10.6。兩組間比較均有統(tǒng)計學意義。

　　結(jié)論：動物模型實驗結(jié)果表明，顱內(nèi)高壓是DAVF形成的關(guān)鍵因素。腦缺血引起的腦灌注壓缺乏在這個過程中起著關(guān)鍵作用，顱內(nèi)靜脈壓增高導(dǎo)致HIF-1α表達增加，VEGF表達增加。